综述：生物制造中的血管化：先进组织模型的创新策略

《Cells》：Vascularization in Biofabrication: Innovative Strategies for Advanced Tissue Models

　　

随着组织对器官移植需求的持续增长，生物制造已成为再生医学领域的变革性技术。该技术属于跨学科方法，通过整合细胞、生物材料与生物活性分子，构建具备生物学功能的组织结构及组织模型。然而，由于缺乏血管结构，生物制造构建体的尺寸往往受到限制：大体积构建体内部细胞因氧气与营养供应不足，易出现缺氧及活力下降。此外，对于拟植入体内的构建体而言，与宿主血管系统的整合是其长期存活的关键。因此，改善生物制造构建体血管化的策略已受到广泛关注。本综述聚焦生物制造构建体的体外与体内血管化方法，系统总结了生物制造中常用的血管细胞类型与来源、可整合入支架的信号分子与生物材料，并重点阐述了卵内绒毛尿囊膜（chorioallantoic membrane, CAM）模型与体内动静脉（arteriovenous, AV）袢模型等先进血管化策略。同时，研究人员探讨了血管化在疾病建模与药物筛选等先进组织模型中的作用。尽管血管缺失与尺寸限制仍制约着生物制造构建体的临床转化，但该技术在组织替代、个性化医疗及减少动物实验方面展现出巨大潜力。

1. 1.
   引言
   近几十年的科学突破显著提升了患者预期寿命，同时也导致组织与器官移植需求激增。终末期器官衰竭的主要治疗手段仍为活体或 deceased 供体器官移植，但供体短缺、移植物排斥及免疫抑制相关并发症仍是临床面临的严峻挑战。生物制造与组织工程旨在通过整合生物材料、细胞与工程技术构建组织或器官替代物，既可用于替换受损或病变组织，也可作为高级体外模型用于健康与疾病组织的机制研究。这类模型可减少研究中的动物使用量，支持人源甚至患者来源细胞的应用，从而更精准地模拟临床场景，提升临床转化效率。传统组织工程多采用患者来源细胞接种于各类生物材料支架的策略；而生物制造特指在三维支架或水凝胶中精准分布细胞、生物材料及生物活性因子，通过空间排布最终获得具备生物学功能的产品，其核心特征是对活细胞与生物材料的可控构建与空间分布，常借助生物打印技术实现。尽管生物打印具有快速、低成本、可实现细胞结构化排布及便于跨团队共享等优势，但氧扩散在活组织中仅限100–200 μm范围，被动扩散无法满足大体积构建体的需求，导致内部细胞缺氧、活力降低甚至坏死。对于拟植入体内的临床级构建体，快速整合入宿主血管系统是保障其长期存活、功能发挥及组织再生的关键，因此构建血管化组织仍是生物制造领域的核心挑战之一。常规策略如三维打印管状结构或共培养脐静脉内皮细胞虽可改善氧与营养扩散，但难以复刻体内微环境的复杂性，尤其是内皮细胞的特异性表型与组织特异功能。基于此，本研究重点关注更能模拟生理条件的先进血管化策略，如CAM模型与AV袢模型，其为研究构建体的组织整合、血管生成及功能性血管网络形成提供了动态且高血管化的研究环境。本综述首先概述常用细胞类型、信号分子与生物材料，随后阐述生物制造模型中整合血管组分的核心策略及体外血管生成检测的主要方法，重点讨论CAM模型与AV袢模型等体内先进方法，接着介绍血管化生物制造构建体在高级组织模型、药物筛选平台及个性化医疗等领域的应用，最后展望生物制造血管化领域的未来发展方向，包括技术与应用的潜在突破。本研究检索PubMed数据库，以“biofabrication”“vascularization”“vascular cells”“bioprinting”“angiogenesis”“tissue models”为核心检索词，主要纳入2015–2026年发表的原始研究，必要时纳入系统综述、叙述性综述及基础概念相关的早期文献。
2. 2.
   生物制造构建体的血管化策略
   充足的氧与营养供应是生物制造构建体中细胞存活的核心前提。人体内血管网络负责运输血细胞、氧气与营养物质，在器官与组织稳态维持中发挥关键作用，复刻其功能是实现复杂生物制造模型的基础。由于氧有效扩散极限为100–200 μm，大体积构建体内部细胞常面临缺氧与营养匮乏，进而导致坏死与功能丧失，因此必须实现大体积构建体的高效血管化。血管化策略主要分为体外、卵内与体内三类：体外可通过三维打印构建类血管管状结构改善氧与营养扩散，添加血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）、血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor, PDGF）等促血管生成因子促进包埋血管细胞的出芽、迁移与增殖；卵内CAM是发育中禽胚的高血管化膜结构，可用于分析生物材料的血管生成特性；体内则可将构建体植入高血管化区域，或通过AV袢实现轴向血管化。现有研究多仅包含简单管状结构或永生化人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）等有限血管组分，虽可改善氧与营养供应，但无法复刻体内复杂的血管微环境。天然血管不仅存在器官间与发育阶段的异质性，还由内皮细胞、平滑肌细胞、周细胞等多种细胞类型共同构成，各细胞类型对血管系统功能维持至关重要，需在构建体设计中予以充分考虑。胚胎发育过程中，血管发生主要通过血管发生（vasculogenesis）与血管生成（angiogenesis）两种途径：血管发生指中胚层来源前体细胞从头形成血管的过程，即中胚层前体细胞分化为内皮祖细胞并形成初始血管结构；血管生成则是通过现有血管的出芽、分裂或融合形成新血管的过程，分为出芽式血管生成与插入式血管生成两类。出芽式血管生成是成熟机体中新血管形成的主要方式：促血管生成因子如VEGF刺激血管内皮细胞增殖迁移，顶端细胞向外出芽并向信号源迁移，后续的柄细胞增殖形成中空管腔，最终通过新形成的管状结构相互连接构建血管网络。插入式血管生成又称分裂式血管生成，即单个现有血管通过向内折叠分为两个独立血管：毛细血管相对两壁形成接触区，内皮细胞间连接重构并使双层膜穿孔，细胞迁入管腔，接触区形成含细胞外基质成分的组织核心，最终完成血管分离并保持功能完整性。相较于出芽式血管生成，插入式血管生成主要依赖现有细胞的重排，在胚胎发育中更为关键。血管发生与血管生成的各阶段受多种转录因子的差异调控，同时受缺氧、机械信号、糖代谢等代谢与环境因素的调节，因此培养条件对体外血管细胞的增殖、迁移及基因表达具有显著影响。

2.1 血管细胞的类型与来源

血管由三类核心细胞组成：内皮细胞构成血液与周围组织间的选择性通透屏障，平滑肌细胞调控血管收缩，周细胞维持稳态与止血。血管细胞的功能不仅存在细胞类型差异，还具有显著的起源组织异质性，单细胞转录组学数据显示人类19种不同器官与组织中可鉴定出42种 distinct 血管细胞类型，构建真实体外组织模型时需充分考虑这种异质性。尽管内皮细胞因易获取、培养相对简便成为生物制造中最常用的细胞类型，但包含多种血管细胞类型的先进组织模型正逐渐增多，例如为更好复刻天然功能，许多模型已开始采用器官特异性血管细胞。

2.1.1 血管内皮细胞

血管内皮细胞具有高度异质性，在体内执行特异性功能。动脉与静脉内皮细胞在形态、基因表达及细胞间连接组织上均存在差异：动脉内皮细胞呈长梭形，细胞间连接更紧密；静脉内皮细胞呈圆形，紧密连接更疏松。不同组织器官的内皮细胞形态与功能也存在显著差异，如肾脏的窗孔状内皮通透性极高，利于代谢废物与毒素清除；血脑屏障的内皮细胞则因紧密连接形成高度选择性的结构屏障，限制血液源性分子进入脑组织。因此生物制造中选择内皮细胞来源需匹配目标组织功能，例如肾模型应采用肾内皮细胞，中枢神经系统模型宜采用脑内皮细胞，同时需注意供体性别对内皮细胞转录组特征的潜在影响。HUVECs因分离培养简便被广泛应用，但其功能可能无法完全复刻组织特异性内皮细胞。原代HUVECs体外可传代至65代，但随传代会发生衰老相关的形态与基因表达改变，建议采用低代次细胞。为延长HUVECs寿命，已建立多种永生化细胞系，如EA.hy926细胞系为HUVECs与人肺癌细胞系的杂交株，虽保留内皮细胞基因表达谱，但也表达部分HUVECs不存在的基因；通过异位表达人端粒酶催化亚基（human telomerase reverse transcriptase, hTERT）永生化的HUVECs虽维持多数内皮标记基因表达，但仍与原代细胞存在基因表达差异，其适用性需根据具体应用场景验证。

2.1.2 诱导多能干细胞

人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells, hiPSCs）可分化为内皮细胞。2006年山中伸弥团队证实，通过过表达Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc四种转录因子（即“山中因子”）可将成年小鼠成纤维细胞重编程为胚胎干细胞样状态。目前已建立多种hiPSCs诱导及向不同细胞类型分化的方案，hiPSCs来源的内皮细胞（hiPSC-ECs）可进一步分化为动脉、静脉或器官特异性表型。但hiPSC-ECs的生成与分化流程繁琐、成本高昂，且供体遗传背景与表观遗传因素会影响分化效率：RNA测序分析显示，供体年龄、性别、体重指数等生物学变量仅影响少数基因的表达，基因表达差异主要源于个体间的遗传差异，这可能导致不同供体来源的hiPSC-ECs存在较高变异性。不过患者特异性hiPSC-ECs在疾病建模与个性化医疗中具有重要价值，例如研究人员利用患者来源hiPSC-ECs揭示了非典型溶血性尿毒症的内皮细胞功能缺陷，包括迁移与增殖能力下降、p38/MAPK信号异常；2型糖尿病供体来源的hiPSC-ECs则表现出衰老加速、线粒体功能受损及血管生成潜能降低等特征。

2.1.3 内皮祖细胞

内皮祖细胞（endothelial progenitor cells, EPCs）是一类可分化为成熟内皮细胞的祖细胞亚群，体外可通过添加VEGF等生长因子诱导分化。EPCs最初被认为起源于骨髓，近期研究提示其定位于血管壁内的血管龛中，可从外周血、骨髓、脐血或脂肪组织等多种来源分离。目前EPCs主要通过CD34、VEGFR2、CD31、CD146、CD144等表面标记鉴定，但由于缺乏标准化的EPCs特异性标记，不同研究的鉴定与表征方法差异较大，限制了结果的可重复性。原代EPCs丰度较低，获取受限，目前已建立HEPC-CB1等永生化EPC细胞系。

2.1.4 间充质干细胞

间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）也可分化为内皮细胞，可从骨髓、脂肪组织、脐带、牙髓或滑膜等多种组织分离，在VEGF等生长因子刺激下可向内皮细胞谱系分化，bFGF等其他生长因子也可协同促进分化。但MSCs的异质性较高，其分化效率受来源、分离方法及诱导方案的影响显著。

2.1.5 血管平滑肌细胞

血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）位于血管中膜层，通过收缩与舒张调控血流、血管直径与血压。原代VSMCs可通过大血管（如小鼠或大鼠主动脉）的酶解分离获得，人源VSMCs还可从脐带、颈动脉动脉粥样硬化斑块或接受旁路手术患者的乳内动脉中获取，也可通过hiPSCs定向分化获得。在生物制造中，VSMCs是构建具备收缩功能血管模型的核心组分，例如研究人员构建了周向排列VSMCs的水凝胶通道，复刻了其在血管中的天然排列模式；也有研究通过对血管移植物上的VSMCs施加电刺激，诱导其向收缩表型转化。

2.1.6 周细胞

周细胞是一类特化的收缩细胞，沿毛细血管及小血管外壁分布，嵌入基底膜并与内皮细胞紧密接触，在血管生成、组织再生及局部毛细血管血流调控中发挥核心作用，在中枢神经系统中更是血脑屏障的重要组成部分。周细胞的功能与形态具有显著的组织起源异质性及毛细血管床位置依赖性，分离时需根据目标组织选择合适的方案，可从脑、心脏、脐带等多种组织分离，也可通过hiPSCs定向分化获得。由于其器官特异性功能，周细胞的应用不仅限于血管构建体，例如研究人员将周细胞整合入呼吸上皮三维模型，也有团队将其纳入血脑屏障模型中。

2.2 促血管生成信号分子的整合

为促进血管生长与成熟，可将促血管生成因子整合入生物制造支架，包括生长因子、肽标签与生物活性玻璃等。

2.2.1 促血管生成生长因子

支架材料中可补充VEGF-A、bFGF或PDGF等生长因子，以促进植入细胞的增殖与分化。将生长因子整合入水凝胶支架的优势包括延长半衰期、减少突释效应与不必要的扩散，以及可通过三维打印实现空间精准排布。也可将表达信号分子的细胞包埋入构建体，血管内皮细胞、成骨细胞、成纤维细胞等多种细胞可天然表达促血管生成生长因子，生物打印过程本身即可增强这些细胞的信号因子表达，大体积构建体中的缺氧微环境也是促血管生成生长因子的天然诱导因素，还可通过转染技术构建组成型或缺氧诱导型基因表达系统，实现促血管生成因子的可控过表达。VEGF-A是研究最深入、应用最广泛的促血管生成生长因子，属于VEGF家族（包括VEGF-A、胎盘生长因子PGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D），因发现最早且在血管生成调控中起主导作用，常被简称为VEGF，其可刺激内皮细胞的增殖、分化、迁移与存活，同时增加血管通透性。bFGF（即FGF-2）常与VEGF-A联用以发挥协同效应，除促进内皮细胞存活、增殖与迁移外，还可诱导基质金属蛋白酶（matrix metalloproteases, MMPs）等细胞外基质重塑酶的分泌，在内皮细胞迁移与出芽中发挥重要作用。PDGFs家族生长因子可刺激间充质来源细胞（如成纤维细胞、周细胞、平滑肌细胞）的增殖，在血管生成过程中参与血管成熟及周细胞、平滑肌细胞的招募，常与VEGF-A、bFGF联用以促进新生血管的成熟。

2.2.2 肽标签

结构蛋白与信号蛋白胞外基质（extracellular matrix, ECM）的肽表位可被用于设计特定功能的生物材料，这对缺乏黏附位点或信号基序的合成聚合物或非哺乳动物来源材料尤为重要。常见的表位包括RGD基序（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸氨基酸序列），其广泛存在于纤连蛋白、胶原蛋白、骨桥蛋白等多种ECM蛋白中，是不同整合素的识别位点，由于内皮细胞高表达整合素受体，在支架材料中添加RGD基序可显著改善构建体的血管化效率。此外，QK与IQ肽可模拟VEGF-A的功能，也可通过高通量肽库筛选鉴定具有细胞黏附或排斥功能的新型细胞黏附肽。

2.2.3 生物活性玻璃

生物活性玻璃颗粒在骨再生领域应用广泛，首个生物活性玻璃45S5 Bioglass?于20世纪60年代末开发，目前已建立多种成分的生物活性玻璃体系，其可通过离子释放刺激特定的细胞响应，例如硅离子可刺激内皮细胞表达VEGF与FGF，硼酸盐离子则可通过激活MAPK信号通路促进细胞增殖。

1. 3.
   体外血管化策略
   大体积生物制造构建体因缺乏类血管结构，内部区域扩散受限，导致氧与营养供应不足；同时体内植入的构建体常无法整合入宿主血管系统，限制植入细胞存活。针对上述挑战，可采用添加血管细胞、三维生物打印构建管状结构、引入牺牲材料提高孔隙率等策略。
   3.1 血管细胞的整合
   为在生物制造构建体中引入简单血管组分，可将内皮细胞无空间排布地包埋入水凝胶基质，细胞可自组装形成微血管网络，但缺乏信号引导的网络通常不稳定且组织性差。研究显示，对构建体中内皮细胞的图案化与有序排布至关重要，在基质中添加VEGF或血管生成素-1等促血管生成信号分子可促进内皮细胞的增殖与管状结构形成，与周细胞或成纤维细胞等细胞共培养也可协同促进内皮网络的形成。但对于更大更复杂的生物制造构建体，仍需结合三维生物打印等空间排布策略。
   3.2 三维生物打印
   生物制造中，三维生物打印常用于实现细胞在三维构建体中的精准空间排布，并实现流程自动化，也可用于构建模拟天然组织血管结构的管状结构。三维打印又称增材制造，指通过逐层堆积材料制备三维物体的工艺，广泛应用于工业、医疗及科研领域，其中不含细胞的常规三维打印与直接打印活细胞的生物打印有所区别。生物打印指在计算机辅助下，将细胞、生长因子、生物材料等生物组分精准组装为类组织构建体，其核心是采用生物相容性物质（通常为生物聚合物水凝胶）作为支撑打印过程的结构基质。生物墨水定义为细胞与可打印支架材料的复合物，不含细胞的打印材料常被称为生物材料墨水。目前主流的三维生物打印技术包括四类：挤出式打印通过气动或机械挤压将高黏度水凝胶等材料从打印喷嘴沉积，适用于构建软组织的细胞聚集体与支架，可精细调控孔隙率、几何形状与连通性，但存在黏度限制、分辨率有限、剪切力与加工温度可能导致细胞损伤、复杂结构打印耗时较长等问题，已成功用于打印含内皮细胞的可灌注管状结构，常与MSCs或平滑肌细胞共打印，细胞存活与成熟情况良好，但生物材料降解会影响长期稳定性。槽式光聚合技术通过可见光或紫外光选择性聚合液态光敏树脂，主要包括立体光刻（stereolithography, SLA）与数字光处理（digital light processing, DLP）两类：SLA通过高精度激光束逐层光聚合生物相容性树脂，DLP则通过数字微镜器件一次性交联整层树脂，DLP打印速度通常快于SLA，SLA分辨率略高。光交联水凝胶如明胶甲基丙烯酰（gelatin methacryloyl, GelMA）、甲基丙烯酰化透明质酸（methacrylated hyaluronic acid, HAMA）、甲基丙烯酰化丝素蛋白（Sil-MA）兼容多种细胞类型且可高精度打印，SLA的高分辨率已用于构建含复杂通道网络的水凝胶支架，结合双光子光聚合技术可获得10–30 μm的微血管级通道。喷墨式生物打印通过热驱动或压电驱动产生皮升级生物墨水液滴并选择性沉积到基底上，无需打印喷嘴，可适配多种黏度生物墨水，避免挤出式打印常见的堵塞问题，适合构建高分辨率组织模型，但热与机械应力会降低细胞存活率，细胞聚集导致的喷嘴堵塞也会限制打印构建体中的细胞密度，已有团队实现了分叉类血管结构的逐层打印。激光辅助生物打印利用激光束通过脉冲激光诱导前向转移技术捕获并沉积细胞或将材料从供体膜转移到接收基底，打印精度与分辨率极高，适合多层细胞图案化与原位生物打印，细胞所受机械应力低于其他打印方法，打印后细胞活力高，但设备与材料成本高昂，限制了其在小型实验室的应用。
   3.3 牺牲材料
   牺牲材料可用于构建中空结构或提供物理支撑，可与非牺牲水凝胶同步打印为空心结构的物理支撑，也可直接掺入水凝胶基质以提高构建体的孔隙率，待生物墨水交联后移除牺牲材料，留下内部空腔结构。常用牺牲材料包括明胶、普朗尼克、聚乙烯醇（polyvinyl alcohol, PVA）、海藻酸盐等，移除机制取决于材料的理化性质：明胶为温敏材料，37°C时为水溶液，低于30°C时凝胶化，可通过升温至37°C以上移除；普朗尼克高于20°C时凝胶化，4°C时液化，可通过降温移除；PVA等水溶性材料可通过水溶液溶解移除；离子交联的海藻酸盐可通过添加螯合剂移除。为提高大体积构建体的扩散效率，可通过添加牺牲微粒等致孔剂提高水凝胶支架的孔隙率，更高的孔隙率可促进氧在基质中的扩散，也可改善包埋内皮细胞的自组织能力，形成类微血管结构，也可通过控制气泡形成制备发泡水凝胶。此外，可三维打印含可灌注微通道的构建体模拟血管网络，为防止通道塌陷，可在周围水凝胶基质交联前用牺牲材料填充通道，双光子聚合等先进打印技术可实现高分辨率的微血管样结构构建。
   3.4 体外血管生成评估
   对于拟体内植入的生物制造构建体，需通过血管生成检测评估生物材料的血管生成潜能，排除其对血管细胞的潜在负面影响，同时确定基质中促血管生成物质的最佳浓度。常用检测方法包括：WST-8比色法检测细胞代谢活性，可初步评估内皮细胞在构建体中的存活与增殖情况，但特异性有限；球体出芽实验将内皮细胞球体包埋入水凝胶基质，定量检测出芽数量、出芽长度及细胞在基质中的迁移情况，结合成像与分析自动化可实现高通量筛选，但结果可能受铸造与水凝胶打印工艺差异的影响；管形成实验主要用于检测接种于基底膜上的内皮细胞形成毛细血管样结构的能力，可在培养基中添加促/抗血管生成物质，定量检测管状结构数量、分支点数量及管长，也可用于评估包埋于水凝胶中的内皮细胞的管形成能力。此外，禽类CAM模型可作为衔接体外与体内检测的桥梁，将在后续章节详细阐述。
2. 4.
   绒毛尿囊膜模型
   作为体外与体内模型的中间过渡，禽类CAM模型兼具优势：体外检测通常仅包含单一细胞类型，无法复刻血管生成的多个环节；体内血管生成检测成本高、耗时长且需动物实验审批。而CAM模型提供了包含快速发育、易获取血管网络的生理环境，同时规避了多数动物实验相关的法规限制。该模型常用于测试促/抗血管生成物质的作用，在生物制造领域也展现出巨大的应用潜力，可用于研究生物制造构建体的血管化过程。绒毛尿囊膜是中胚层来源的绒毛膜与尿囊融合形成的高度血管化膜结构，可为胚胎提供营养、实现气体交换，并吸收蛋壳中的钙以支持骨骼发育。鸡胚中尿囊于胚胎第3天（embryonic day, ED3）作为内胚层后肠的突起出现，ED4–10期间尿囊血管快速增大，尿囊中胚层与邻近绒毛膜中胚层融合形成绒毛尿囊膜，血管系统发育于ED10完成，CAM于ED13完全分化。鸡胚发育周期为21天，实验窗口期约为7天（ED7–14），由于鸡胚在ED17前不被认定为活体动物，CAM模型实验通常无需动物实验审批。ED18后胚胎免疫系统发育成熟，限制了异种细胞的植入，目前普遍认为鸡胚在ED14前无痛觉感知，但该结论尚未完全明确。CAM模型可采用卵内培养（蛋壳基本完整）或卵外培养（内容物转移至其他容器）：卵内培养环境更接近生理状态，胚胎存活率更高，但观察与操作空间有限；卵外培养便于实验操作与活体成像，但胚胎死亡率更高。除鸡胚外，该模型也可应用于鹌鹑、鸭、鸵鸟等其他禽类：日本鹌鹑蛋体积小、蛋壳薄，便于操作且孵化器占用空间小，可于6孔板中进行卵外培养，其发育周期约16.5天，实验窗口期为7天（ED6–12）；火鸡与绿头鸭等大型禽类胚胎发育较慢（孵化期26–28天），但受精蛋获取难度大且实验数据有限；鸵鸟作为现存最大鸟类，其CAM面积最大，发育周期42天，蛋体积约为鸡蛋的50倍，为实验操作提供了新可能，大表面积与更长孵化期有利于体内肿瘤生长研究，还可兼容用于人类检查的常规成像设备（如正电子发射断层扫描PET设备），便于进行血管内注射与采血。CAM模型最早于1912年被用于肉瘤细胞植入发育鸡胚的研究，目前广泛应用于血管发育与血管生成研究、癌症研究及毒性筛查。在生物制造领域，该模型可用于测试生物材料的生物相容性、血管生成潜能及支架整合能力：测试物质可直接施加于CAM表面或包埋入水凝胶基质，血管与分支数量可通过人工计数或ImageJ、Matlab、CellProfiler等数字图像分析工具定量，也可通过定量PCR比较促血管生成基因的表达，通过活体显微镜监测CAM血管的长期发育动态。癌症研究中，肿瘤细胞可悬浮或包埋于水凝胶基质后移植至CAM，用于研究癌细胞运动、侵袭与转移等无法在体外完全复刻的机制，结合生物打印技术可构建复杂支架并置于CAM上，研究其与血管的相互作用及癌细胞的转移行为。该模型也可直接用于生物制造支架的血管化研究，例如研究人员将纳米复合支架植入CAM，比较了不同支架组成的血管化程度；也有研究证实预血管化球体包埋于明胶基质后可实现与CAM血管网的吻合；还可用于评估生物活性玻璃颗粒等常用添加剂的效果，例如介孔生物活性玻璃颗粒可提高CAM的血管密度。相较于啮齿类体内模型，CAM模型样本量更大、实验周期更短，可用于优化添加剂的浓度与组成，其结果可进一步在其他动物模型中验证。
3. 5.
   生物制造构建体的体内血管化
   生物制造构建体植入动物模型后，快速整合入宿主血管系统是其成功定植与植入细胞存活的关键，目前已开发多种策略增强构建体的血管化。三维打印的管状结构可促进植入支架的的新生血管形成，例如研究人员采用含内皮细胞与脂肪来源干细胞（adipose-derived stem cells, ADSC）的生物墨水打印微血管图案，增强了小鼠模型中的移植物血管化；为加速血管招募，可在构建体中补充VEGF、bFGF、PDGF等促血管生成生长因子，例如将VEGF整合入三维打印支架实现缓释，改善了大鼠皮下植入后的血管化，也有团队开发了补充VEGF与PDGF的血管移植物用于血管重建。也可在构建体中预先包埋内皮细胞，其在体内重塑为微血管，例如过表达存活基因Bcl-2的HUVECs植入小鼠模型后可形成有灌注的血管结构。另一种策略是将构建体植入体内高血管化区域进行预血管化，数周的植入期内宿主血管可长入构建体，随后将预血管化支架切取并转移至缺损部位，例如骨再生支架可预植入肌袋，神经再生支架可通过皮下植入预血管化。动物模型中也可通过血管束或AV袢模型诱导轴向血管化：血管束技术将动脉与静脉从周围组织中解剖游离后置于支架或植入腔内，提供内在血管化，例如大鼠临界尺寸骨缺损模型中，联合应用三维打印支架与包含腹壁动脉与静脉的血管束，补充促血管生成与成骨的骨形态发生蛋白9（bone morphogenic protein 9, BMP-9）可进一步改善缺损部位的骨量与骨愈合；补充脂肪来源干细胞也可增强血管束对水凝胶支架的血管化效果。尽管血管束技术手术操作更简单，但AV袢模型显示出更高的血管生成与组织生成水平，其具体研究如下。
   动静脉（AV）袢模型
   大鼠AV袢模型最早于1980年由Erol与Spira报道，其观察到动静脉瘘起源的新生毛细血管床形成。手术需在手术显微镜下显微分离大鼠股动脉与股静脉，取对侧肢体倒置静脉移植物（interpositional vein graft, IVG）以保证袢的长度，将IVG与股动脉、股静脉通过间断缝合吻合，随后将AV袢置于可填充水凝胶基质与细胞的植入腔中，血管出芽从袢（尤其是静脉部分）起源，由于血管内压力与剪切应力升高，静脉移植物发生动脉化过程，进而增强血管生成反应。由于血管直径小于1 mm，该步骤需要显微外科技术，回顾性研究显示手术经验与实践时长与手术结局显著相关：经验越丰富，手术时间越短、血栓发生率越低，因袢血管血栓形成被排除分析的动物数量越少。植入腔可分为多孔型与封闭型：多孔腔允许外周外在血管化，血管化程度更高；封闭腔仅通过AV袢血管化，可减少外部因素对植入构建体的干扰，也有研究采用观察腔结合活体显微镜，可在植入期间可视化观察生长中的血管网络。尽管植入腔通常填充水凝胶基质，但也有研究显示无额外基质时AV袢仍可起源形成新组织。该模型虽主要应用于大鼠，也可在兔、绵羊、山羊等大型动物中实施，以构建更符合临床尺寸要求的构建体：兔AV袢模型将腘动脉与股静脉吻合，无需IVG，可获得6×8×10 mm³的血管化骨替代物；山羊下颌骨缺损模型中，利用面部血管构建AV袢，可植入2×3 cm²的支架；绵羊AV袢模型吻合隐动脉与隐静脉，可生成16 cm³的血管化骨组织用于长骨缺损模型，也可补充自体MSCs与EPCs以增强成骨效果。AV袢模型可用于评估不同生物材料的血管化特性，例如比较静电纺丝与湿法纺丝重组蜘蛛丝矩阵的血管化差异，发现更细的静电纺丝纤维降解更快、血管化程度更高，蜘蛛丝蛋白修饰RGD标签也可增强血管化效果，该模型也被用于评估GelMA与ADA-GEL水凝胶的血管化、降解与生物相容性。该模型还可用于构建生物人工组织：多项研究显示植入骨替代物与成骨/内皮细胞可形成骨组织，牛松质骨基质补充成骨细胞植入大鼠AV袢模型后，成骨细胞存活率显著高于皮下植入对照组，但观察到明显的基质异物反应，凸显了体内模型评估生物相容性的重要性，补充MSCs与BMP-2可进一步改善AV袢模型中的骨形成，且AV袢的内在血管化可显著提升骨形成效率，该技术已在临界尺寸股骨缺损模型中验证了其治疗骨缺损的潜力。此外，该模型可用于构建心肌肌瓣：将心肌细胞植入AV袢腔形成的肌瓣可自发收缩，移植入受体大鼠后4周内心肌细胞持续存活，但未观察到宿主心肌与肌瓣心肌的直接接触。骨骼肌组织构建方面，将成肌细胞植入经AV袢预血管化的纤维蛋白基质后，成肌细胞存活并保留成肌表型，但未观察到骨骼肌样组织形成；由于神经刺激对功能性肌肉组织发育至关重要，研究者开发了神经化改良的EPI袢模型，联合应用隐动脉、腹壁浅静脉与运动神经分支诱导植入细胞的肌源性分化，后续改良采用腹壁浅动脉优化血管角度，成功构建了血管化、神经化的骨骼肌组织。该模型也可用于研究肿瘤的增殖、转移、休眠及肿瘤-间质相互作用等特征，例如建立乳腺癌模型比较海藻酸盐、纤维蛋白、聚己内酯等不同基质材料的影响，黑色素瘤模型研究显示，Matrigel或海藻酸盐/明胶/透明质酸基质中的黑色素瘤细胞增殖率高，而商业化Cellink生物墨水中的细胞进入休眠状态。植入基质也可通过三维打印实现构建体空间结构的精准调控，例如重组蜘蛛丝基质打印中，血管生成主要发生在铸造水凝胶区域；ADA-GEL构建体联合黑色素瘤细胞的不同打印设计可导致肿瘤生长与纤维血管组织形成的差异，推测与ADA-GEL基质的溶胀行为有关，若构建体设计未考虑溶胀导致的尺寸增加，可能压迫AV袢影响血流，提示在AV袢等敏感实验系统中需充分考虑打印设计与材料行为的影响。
4. 6.
   血管化生物制造构建体在先进组织模型中的应用
   生物制造在构建先进体外组织模型方面潜力巨大，可用于器官功能研究、疾病建模与药理研究。二维培养系统中的细胞在形态、基因表达及治疗敏感性上与三维系统存在显著差异，且无法复刻体内细胞-细胞、细胞-基质相互作用及氧与营养的空间时间分布等核心特征。不同的生物打印方法与生物材料可构建包含ECM组分、组织特异性细胞类型及类血管结构的组织模型，但天然组织器官的复杂性仍是主要限制：器官不仅具有高度有序的分层结构，还由多种特化细胞类型构成，不同细胞类型对营养、生长因子、细胞间与细胞-基质接触的需求各异，以维持其天然表型；同时构建体尺寸仍受限于氧与营养扩散障碍，因此许多先进组织模型已引入可灌注通道或血管细胞以模拟血管系统，这类模型在基础研究、疾病建模、药物筛选与个性化医疗中具有重要价值，但目前仍仅能模拟天然器官的部分功能。
   肾脏生物制造模型因肾脏在药物清除中的核心作用备受关注，其包含肾小球滤过屏障、近端小管、远端小管等复杂结构，对三维生物打印与微流控技术提出了挑战，现有模型多仅复刻肾脏的部分结构，例如研究人员通过种子近端小管上皮细胞与血管内皮细胞至三维打印管状结构，构建了近端小管模型，采用组织特异性细胞更好地复刻了肾内皮细胞的天然功能；也有研究采用脱细胞肾ECM与小管上皮细胞构建血管化的肾实质模型，但采用了HUVECs而非肾内皮细胞。由于药物性肾毒性是新化合物筛选的重要关注点，部分生物打印肾脏模型专门适配于毒性筛选，例如包含肾成纤维细胞、HUVECs与小管上皮细胞的生物打印近端小管模型，经顺铂处理后呈剂量依赖性组织活力下降，经TGF-β处理后出现纤维化反应；肝-肾联合芯片模型可同时评估肝毒性与肾毒性，整合了肝窦内皮细胞与HUVECs以引入血管组分。
   生物打印肝脏模型已被证实可合成白蛋白、尿素、乳酸脱氢酶等肝脏特异性蛋白与代谢产物，许多先进模型包含血管元件，例如整合可灌注通道或包埋内皮细胞，采用患者来源细胞已构建多种肝病的临床前模型，例如打印包含健康与病变细胞（含肝窦内皮细胞）的嵌合组织模型，研究非酒精性脂肪性肝炎中不同肝细胞类型的作用；也有研究采用包含HUVECs的生物打印肝脏模型评估致纤维化因子在肝纤维化发生中的作用。
   心脏生物制造领域，生物打印技术的进步已实现源自心肌细胞的收缩性心脏模型构建，多项研究报道的生物打印心脏模型可维持数周的同步收缩，并对药理或电刺激产生响应，部分模型采用患者来源细胞研究先天性心脏病，例如采用左心发育不良综合征患者来源的hiPSC衍生的心肌细胞打印心脏组织构建体，研究疾病的分子机制。加入血管组分可进一步提升心脏模型的复杂度，例如研究人员构建了生物打印的内皮化心肌片上模型：先打印含内皮细胞的 hydrogel 支架，内皮细胞迁移至周边形成汇合的内皮层，随后种子心肌细胞生成具备自发收缩能力的心肌结构，嵌入微流控灌注生物反应器后，经抗肿瘤药物阿霉素处理，构建体搏动频率显著下降，显示了其作为心脏毒性药物筛选平台的潜力；也有研究显示在含HUVECs的心脏片上模型中加入巨噬细胞，可促进微血管的稳定。
   皮肤替代物的生物制造对大面积皮肤缺损治疗具有重要临床意义，因自体皮移植来源有限。皮肤包含表皮、真皮、皮下组织三层，各层含不同细胞类型，构建模型时需复刻分层结构：表皮层与真皮层可分别采用角质形成细胞与成纤维细胞复刻，色素沉着与毛囊层则需整合黑素细胞与毛囊真皮乳头细胞。生物制造皮肤模型中，三维打印用于不同细胞类型的空间排布以形成 distinct 皮肤层，例如包含6种细胞类型（含真皮微血管内皮细胞）的多层皮肤替代物，在小鼠模型中可加速伤口愈合并实现宿主血管整合；也有研究在双层导电皮肤支架中整合HUVECs、成纤维细胞与角质形成细胞，获得了类似效果。
   其他血管化组织模型的构建也高度依赖细胞的空间精准分布，例如通过生物打印iPSC衍生的内皮细胞、周细胞与成纤维细胞复刻外层血-视网膜屏障的分层结构，顶层种子视网膜色素上皮细胞；构建包含星形胶质细胞、周细胞与永生化脑内皮细胞的可灌注血脑屏障模型；打印包含肺泡细胞、肺成纤维细胞与肺微血管内皮细胞的三层肺泡屏障模型。近年来生物制造在多器官模型与器官芯片系统方面的进展已被多篇综述详细阐述。
   癌症研究中，肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）的作用日益受到关注，TME包含癌症相关成纤维细胞、免疫细胞、间充质细胞等间质细胞类型，以及血管、信号分子与ECM成分，显著影响肿瘤细胞的增殖、转移与治疗抵抗，临床相关性极高。为在体外复刻肿瘤生态位，三维打印癌症模型已整合TME的多种特征，例如在神经母细胞瘤模型中通过三维打印内皮细胞衬里的通道引入血管组分，在骨髓瘤模型中整合MSCs与内皮祖细胞以复刻骨内膜与血管周围亚龛。二维培养中的细胞通常比三维培养中的细胞对药物治疗更敏感，导致大量化合物在二维筛选中表现优异，但在后续体内研究中失败。近年来已开发多种三维筛选模型，通过自动化生成多细胞肿瘤球体或类器官，构建生物制造三维筛选平台，部分模型已整合血管细胞，也可添加成纤维细胞、胰腺星状细胞或免疫细胞等以引入TME组分。目前生物打印的肝、心、肾等组织模型已适配于药物筛选，进一步整合患者来源细胞可预测治疗反应，推动个性化医疗的发展。
5. 7.
   生物制造的未来展望
   血管化生物制造构建体在体外与体内研究中均展现出巨大潜力，通过引入血管组分，构建体可更贴近天然体内环境。但该技术的临床转化仍处于早期阶段：尽管许多构建体在体外或小型动物