三丁基锡分子在三磷酸脱氧核苷(DNA)合成依赖或不依赖白细胞介素-2(IL-2)作为生长因子的人类T淋巴细胞病毒1型(HTLV-1)感染细胞中诱导细胞死亡机制的研究

《International Journal of Molecular Sciences》：Investigating the Mechanisms Underlying Cell Death Induction by a Tributyltin Molecule in HTLV-1-Infected Cells Dependent or Not on IL-2 as a Growth Factor

　　

摘要：人类T淋巴细胞病毒1型(Human T-lymphotropic virus type 1, HTLV-1)终身感染全球至少500万～1000万人，少数感染者会发展为成人T细胞白血病/淋巴瘤(adult T-cell Leukemia/lymphoma, ATL)及HTLV-1相关脊髓病/tropical spastic paraparesis(HAM/TSP)等致死性疾病。目前尚无针对HTLV-1感染或其所致疾病的疫苗或治愈性疗法。研究人员此前发现，三丁基锡分子Bu3SnOCOCF3(tributyltin, TBT)——其诱导包括高致瘤细胞系在内多种细胞系细胞毒性的效力强于顺铂(cisplatin)——对模拟不同病毒驱动转化状态的HTLV-1感染细胞系亦具强细胞毒性，但其诱导的细胞死亡类型尚不明晰。本研究以体外HTLV-1感染制备、经逐步筛选获得的对IL-2生长因子呈依赖(PB2/IL-2)或渐进性不依赖(PB2/NO-IL-2)的HTLV-1永生化淋巴细胞为对象，探讨TBT对病毒学参数及细胞死亡参数的影响。分子研究表明TBT影响HTLV-1病毒基因表达，尤以HBZ基因为甚。TBT对所检测HTLV-1感染细胞系展现高细胞毒潜能，对IL-2非依赖HTLV-1感染细胞作用更强。细胞死亡机制研究显示TBT可激活caspase-3与caspase-8并引发凋亡(apoptotic)反应；此外细胞焦亡(pyroptosis)及其他未特指的溶解性死亡(lytic death)形式亦参与TBT诱导的HTLV-1感染细胞死亡，而该化合物同时激活的自噬(autophagic)反应似可减弱细胞死亡。综上，本研究阐明TBT在HTLV-1感染细胞中诱导细胞死亡的独特特征谱，可为后续验证有机锡化合物抗HTLV-1相关疾病的潜力提供依据。

论文解读：三丁基锡(TBT)在HTLV-1感染淋巴细胞的细胞死亡诱导及抗病毒机制研究

研究背景与目的

人类T淋巴细胞病毒1型(Human T-lymphotropic virus type 1, HTLV-1)全球感染约8250万人，可致成人T细胞白血病/淋巴瘤(adult T-cell leukemia/lymphoma, ATL)及HTLV-1相关脊髓病(HAM/TSP)，目前无治愈性疗法。顺铂(cisplatin)等含金属抗肿瘤药存在系统毒性与耐药问题，有机锡(organotin)化合物因结构灵活具潜在抗肿瘤活性。研究人员前期发现三丁基锡三氟乙酸盐[tributylstannyl 2,2,2-trifluoroacetate, Bu₃SnOCOCF₃，简称TBT(Tributyltin)]对HTLV-1感染细胞具强细胞毒性但死亡类型不明。本研究旨在明确TBT在HTLV-1感染、IL-2依赖(PB2/IL-2)与IL-2非依赖(PB2/NO-IL-2)永生化淋巴细胞中诱导细胞死亡的调控机制及病毒基因表达影响，论文发表于International Journal of Molecular Sciences。

主要关键技术方法

研究人员使用体外HTLV-1感染健康供者外周血淋巴细胞构建IL-2依赖(PB2/IL-2)与渐进性IL-2非依赖(PB2/NO-IL-2)HTLV-1永生化T细胞模型；采用Trypan Blue拒染法检测细胞活力；实时活细胞成像(Incucyte^?)以Caspase-3/7 Green及Cytotox Red双染色动态监测凋亡与溶解性死亡；Western Blot检测cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、LC3-I/LC3-II转换及Gasdermin D(GSDMD)剪切；RT-qPCR检测HTLV-1病毒基因(Pol、Tax、HBZ)及焦亡相关基因(CASP1、IL-1β、TNF-α)；Hoechst 33342核染色观察核形态改变并以焦亡抑制剂双硫仑(disulfiram)及自噬抑制剂wortmannin干预验证。

研究结果

2.1. Effects of TBT on Viral Gene Expression in HTLV-1-Infected Cells

以5 μM TBT处理6 h后，PB2/IL-2细胞Pol、Tax、HBZ mRNA无显著变化；PB2/NO-IL-2细胞中三者均极显著下调(p < 0.0001)。未处理PB2/NO-IL-2细胞基线Pol(p < 0.001)、Tax(p < 0.0001)、HBZ(p < 0.01)表达高于PB2/IL-2。结论：TBT早期特异性抑制更晚期/高活化HTLV-1感染细胞中病毒基因表达，尤以HBZ为著。

2.2. Effects of TBT on Viability of HTLV-1-Infected PB2/IL-2 and PB2/NO-IL-2 Cells in the Early Phase of Treatment

10 μM TBT处理后3、6、12 h检测，两细胞系活细胞数均下降，死细胞数上升，且PB2/NO-IL-2敏感性显著高于PB2/IL-2。结论：TBT引起早期剂量依赖性活力丧失，IL-2非依赖细胞对TBT细胞毒性更敏感。

2.3. Time-Course Analysis of Cell-Death Induction by TBT in HTLV-1-Infected PB2/IL-2 and PB2/NO-IL-2 Cells via Real-Time Quantification of Fluorescent Cells Double-Stained with Green Caspase-3/7 and Red Cytotox Dyes

活细胞实时监测显示TBT处理组Caspase-3/7绿色荧光显著升高（PB2/NO-IL-2更早达峰且更强），随后下降；Cytotox Red红色荧光在PB2/NO-IL-2早期(前12 h)即升高，提示原发性溶解性死亡(primary lytic death)，PB2/IL-2中溶解性死亡较晚出现。双硫仑(disulfiram)单独可诱导溶解性死亡，与TBT联用未抑制红色荧光。结论：TBT同时诱导凋亡性调节性细胞死亡(RCD, regulated cell death)与早期原发性膜溶解性死亡，后者不能被经典焦亡抑制剂完全阻断。

2.4. Evaluation of the Effects of TBT Treatment on Apoptotic Response Parameters in HTLV-1-Infected Cell Lines: Assessment of Caspase-3 and Caspase-8 Activity Through Immunoblot Analysis

5 μM TBT处理2 h，两细胞系均出现cleaved caspase-3(p17)与cleaved caspase-8(p18)，PB2/NO-IL-2中剪切条带更强。结论：TBT通过激活外源性caspase-8及执行性caspase-3诱导HTLV-1感染细胞凋亡，IL-2非依赖细胞凋亡更显著。

2.5. Evaluation of the Effects of TBT Treatment on Pyroptotic Response Parameters in HTLV-1-Infected Cell Lines: Analysis of (i) Inflammatory Gene Expression, (ii) Cell Death Detected by Hoechst Staining Following Disulfiram Cotreatment, and (iii) Gasdermin-D Activation

TBT上调两细胞系CASP1 mRNA（PB2/NO-IL-2更显著），仅PB2/NO-IL-2中IL-1β与TNF-α mRNA显著升高。Hoechst染色显示双硫仑可部分抑制TBT诱导的核形态改变细胞比例。但Western Blot显示TBT诱导GSDMD剪切为p43片段而非成孔性N端p30片段，双硫仑抑制p43生成；未见功能性p30(执行焦亡的GSDMD N-terminal fragment)。结论：TBT可能诱导类焦亡(pyroptosis-like)溶解性死亡或经非经典GSDMD途径，经典焦亡执行步骤未被证实参与。

2.6. Effects of TBT on the Autophagic Response in HTLV-1-Infected Cells

自噬抑制剂wortmannin预孵育后，TBT诱导的核形态异常细胞比例增加(p < 0.05/p < 0.01)，wortmannin单用无毒性。Western Blot显示TBT促进LC3-I向LC3-II转化，PB2/NO-IL-2基线LC3-II水平高于PB2/IL-2。结论：TBT激活保护性自噬(pro-survival autophagy)延缓细胞死亡，抑制自噬增强TBT细胞毒性。

讨论与结论总结

研究人员证实TBT除细胞毒作用外，可在HTLV-1感染较晚期(IL-2非依赖)细胞中早期下调Tax与HBZ病毒癌基因表达，提示其在ATL样转化阶段具协同抗病毒与抗白血病潜力。TBT诱导HTLV-1感染细胞死亡为混合模式：含caspase-3/8依赖的凋亡、早期原发性溶解性死亡(部分具焦亡样特征但未经典GSDMD p30执行)及可能非经典焦亡途径；同时TBT激活代偿性自噬缓解死亡。IL-2非依赖细胞对病毒基因下调、凋亡及溶解性死亡更敏感。自噬抑制剂wortmannin可增敏TBT细胞毒性，提示有机锡与自噬抑制剂联用或为抗HTLV-1疾病新策略。局限性在于未穷尽所有调节性细胞死亡类型及未最终界定是否为新型锡特异性死亡形式。

结论(翻译)：

综上所述，本研究所收集数据勾勒出TBT在HTLV-1感染细胞中诱导细胞死亡的典型复杂特征谱，可为未来全面界定该死亡谱及验证有机锡化合物对抗HTLV-1所致疾病真实潜力的后续研究提供参考。