综述：微流控和纸基重组酶聚合酶扩增系统用于分散式诊断和生物监测

《Micromachines》：Microfluidic and Paper-Based Recombinase Polymerase Amplification Systems for Decentralized Diagnostics and Biosurveillance

　　

重组酶聚合酶扩增（RPA）已成为分散式分子诊断的核心扩增策略，因为它在温和温度下快速操作，且热控制需求远低于PCR。当与微流控和纸基平台结合时，其分析价值显著增加，在这些平台上，样品处理、试剂输送、扩增和信号读取可以组织在紧凑、低功耗和现场兼容的格式中。本综述审视了微流控和纸基RPA系统在生物医学诊断、食品安全检测、环境监测和同一健康（One Health）生物监测方面的最新进展。特别关注集成设备架构，包括离心芯片、毛细管驱动平台、微流控纸基分析装置（μPADs）、电化学生物传感器、CRISPR辅助检测、数字微流控系统和样品到结果（sample-to-answer）卡盒。生物医学应用现已涵盖呼吸道病毒、生殖和新兴感染、细菌和寄生虫病、药物基因组标志物和癌症相关生物标志物。RPA使能平台正稳步进入食品安全和环境监测，涵盖病原体检测、海鲜和乳制品监测、农业病害控制、抗菌素耐药性追踪和空气传播病原体筛查。同时，该领域正转向更智能的诊断格式。智能手机成像、人工智能（AI）辅助解释、数字分区、云连接和自动质量控制正越来越多地集成到快速检测工作流程中，赋予这些系统更强的便携性、一致性和决策价值。尽管取得了这些进展，实际部署仍然依赖于稳健的样品制备、多重稳定性、定量可靠性、试剂储存、可扩展制造和监管验证。预计RPA化学与微流控、纸基装置、CRISPR识别、电化学读出和数据辅助解释的持续融合将支持更稳健和可及的分子诊断工作流程。

论文主体部分总结如下：

**1. Introduction**
分子诊断在医疗、食品安全和环境监测中占据核心地位。与依赖热循环仪和实验室的PCR相比，重组酶聚合酶扩增（RPA）在温和温度（37-42°C）下快速扩增，降低了对热硬件和操作技能的需求，更适合分散式检测。文献综述指出，RPA因其速度、温和热操作和基质耐受性，成为下一代便携式诊断系统的重要基础。

**1.1. Principle and Advantages of RPA**
RPA不依赖反复加热冷却，而是利用重组酶-引物复合物侵入双链DNA，由单链结合蛋白（SSBs）稳定暴露链，链置换聚合酶延伸引物，实现等温扩增。其优势包括：10-30分钟内完成扩增，反应温度低以降低功耗，并能耐受临床样本、食品和环境样品中的常见抑制剂，适用于现场分子诊断。

**1.2. Integration of RPA with Microfluidic Technologies**
微流控技术提供精确流体操控、自动试剂输送和微型化分析流程。早期平台包括连续流微通道和离心盘；随后发展为毛细管驱动、自供电和多重病原体检测芯片。近期设计转向集成式呼吸病毒检测平台和自动化样品到答案（sample-to-answer）卡盒。CRISPR集成微流控系统进一步结合了等温扩增与CRISPR识别，提高特异性并支持多重检测。

**1.3. Emergence of Paper-Based RPA Diagnostics**
纸基平台因低成本、简单制造、可降解和毛细管驱动流而适用于分散式检测。早期RPA纸基系统主要耦合侧流试纸条；新设计集成核酸富集、折纸式几何结构、振动辅助扩增和抑制剂去除组件。纸基CRISPR-RPA设备结合快速扩增与序列特异性CRISPR识别，实现高灵敏度可视化检测，适合低资源环境。

**1.4. Digital Microfluidics and Quantitative RPA Analysis**
传统RPA定性检测可靠，但定量不直接。数字微流控通过将样品分割成孤立隔室（如SlipChip技术和后续数字微流控系统），实现绝对核酸定量。近期数字RPA系统结合自动液滴生成、隔室定量和高通量图像分析，提高低丰度目标灵敏度，并支持机器学习辅助解释。

**1.5. Intelligent and Connected RPA Diagnostic Systems**
人工智能（AI）、智能手机成像、云连接和数字健康基础设施正在改变RPA诊断设计。智能手机支持图像采集、信号提取和结果解释；深度学习模型减少主观差异；自动数字微流控结合机器学习进行液滴识别和信号量化。结果可传输至云平台，支持流行病学监测和人群规模疾病评估。

**2. Biomedical Applications**
生物医学诊断需要离开中心实验室的分子检测。微流控和纸基RPA系统结合快速扩增、紧凑装置和灵活读出，涵盖CRISPR识别、电化学传感、数字微流控、智能手机成像和AI分析，成为临床筛查、传染病检测、生物标志物分析和个性化医疗的诊断引擎。

**2.1. Respiratory Viral Infections**
微流控RPA用于呼吸道病毒诊断，如SARS-CoV-2气溶胶监测、多重检测（SARS-CoV-2、RSV、流感病毒等）和流感亚型鉴定。典型平台如MAPnavi（密封微流控，CRISPR/Cas12a荧光读出，40分钟，1拷贝/μL）和被动驱动RT-RPA-CRISPR/Cas12a芯片（35分钟，侧流试纸条，10拷贝/μL）。离心RPA芯片实现10分钟内流感亚型分析。

**2.2. Reproductive, Blood-Borne, and Emerging Viral Infections**
RPA平台用于HPV、性传播病原体、猴痘病毒（MPXV）、西尼罗病毒（WNV）和人巨细胞病毒（hCMV）检测。例如，多路RPA结合Cas12a和微流控空间编码区分9种HPV基因型（40分钟，0.26 aM）。纸基设备（如手暖器加热）整合核酸分离、RPA和侧流试纸条检测淋病奈瑟菌（30-35分钟，10 DNA拷贝）。RT-RPA-Cas12a DETECTR格式检测WNV谱系（102-103 RNA拷贝）。

**2.3. Tuberculosis, Bacterial, and Parasitic Infectious Diseases**
微流控RPA扩展至结核病（TB）、细菌和寄生虫感染。TB-GoldDx利用IS6110特异性RPA和AuNP比色法，20分钟检测0.001 ng H37Rv DNA，临床灵敏度95.83%。MiND-DMF数字微流控平台整合DNA提取、RPA和CRISPR检测，在55分钟内识别6种细菌（灵敏度100%，特异性98-100%）。自动采样微流控芯片检测尿道感染相关细菌（55分钟，5拷贝/反应）。微流控RPA-CRISPR用于疟原虫筛查和基因分型（10拷贝/反应）。

**2.4. Precision Medicine and Cancer Biomarkers**
RPA用于基因型、突变和甲基化检测。实时RPA-exo探针荧光法检测插入缺失基因型（20分钟，1 ng DNA）。智能手机控制的双重RPA-LFD检测HLA-B*58:01（25分钟，10拷贝/μL）。电化学RPA-CRISPR检测PIK3CA热点突变（229-224拷贝/μL）。甲基化敏感限制酶辅助RPA-CRISPR/Cas12a检测鼻咽癌甲基化位点（100 aM，0.1%甲基化水平）。

**2.5. Challenges and Prospects in Biomedical RPA Diagnostics**
生物医学RPA诊断正转向密封、自动化格式。CRISPR耦合RPA提高特异性；空间编码微流控实现高多重检测。分散式格式（智能手机控制、手动离心、AI辅助）减少实验室依赖。样品制备、多路引物平衡和临床验证仍是主要挑战。最可转化的系统需结合稳健前处理、冻干试剂、密封卡盒和自动质量检查。

**3. Food Safety Applications**
食品安全需要快速检测食品中细菌、病毒、抗菌素耐药性等。微流控和纸基RPA平台结合等温扩增、紧凑流体处理和便携读出，集成CRISPR确认、智能手机成像、电化学传感和数字微流控，缩短检测时间至分钟级。

**3.1. Detection of Foodborne Bacterial Pathogens**
纸-聚合物微流控检测空肠弯曲菌（20分钟，46 CFU/mL）。聚醚砜（PES）折纸微流控检测沙门氏菌（20分钟，260 CFU/mL）。PDMS微流控生物传感系统结合智能手机荧光检测鼠伤寒沙门氏菌（30分钟，1.0×10² 拷贝/μL）。电化学CRISPR-RPA传感器检测金黄色葡萄球菌（3 CFU/mL）。一步法RPA-CRISPR/Cas12a电化学侧流试纸条检测沙门氏菌（3.84 CFU/mL）。

**3.2. Viral and Multiplex Detection of Foodborne Pathogens**
集成微流控RPA-LAMP系统同时检测人诺如病毒（HuNoV）GI和GII（10和1拷贝/μL）。冻干纸基RT-RPA-CRISPR/Cas12a检测诺如病毒（1拷贝/μL，45分钟）。智能手机辅助微流控平台检测8种食源性细菌（60分钟，103-104 CFU/mL）。手指驱动模块化微流控检测牛奶中大肠杆菌O157、沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌（接近1 CFU/mL）。

**3.3. Aquatic and Dairy Product Safety Monitoring**
离心微流控生物传感器检测副溶血性弧菌（1.5小时，6.08拷贝/μL）。可折叠μPAD检测海水和海鲜中副溶血性弧菌（20分钟，102 CFU/mL）。微流控RPA识别商业海鲜产品（20分钟，10拷贝/μL）。电化学RPA-CRISPR/Cas12a检测牛奶中金黄色葡萄球菌（3 CFU/mL）。重组酶辅助扩增（RAA）双试纸条检测荧光假单胞菌（50 CFU/mL）。

**3.4. Electrochemical Food Safety Biosensors**
电化学读出将RPA检测转化为可定量电流响应。RPA介导的E-CRISPR生物传感器检测副溶血性弧菌（32 CFU/mL）。金涂层螺纹电极检测有毒微藻（可扩展多目标）。无固定Cas13a电化学CRISPR检测（30 zM，6种病原体，50分钟）。

**3.5. Challenges and Future Perspectives in Food Safety Testing**
食品基质的异质性（脂肪、蛋白质等）影响核酸回收和扩增效率，需要集成前处理模块。定量仍依赖终点信号，数字微流控和实时荧光可能改善。多重检测需减少交叉反应。实际部署依赖于密封卡盒、冻干试剂、智能手机/AI辅助读出和自然污染食品验证。

**4. Environmental Monitoring Applications**
环境监测需要现场快速检测病原体。微流控和纸基RPA平台结合CRISPR验证、电化学读出和卡盒集成，支持空气、水、土壤、作物和野生动物的分子筛查。

**4.1. Agricultural and Aquatic Environmental Biosurveillance**
微流控核酸芯片捕获空气孢子并检测水稻稻瘟病（1×10²-1×10⁵ CFU/mL）。便携微流控检测松材线虫（40分钟）。离心微流控芯片同时检测虾类病原体（6种标志物，20分钟，10拷贝/μL）。RPA-CRISPR/LbaCas12a-LFD检测有害藻类（60分钟，5×10^-6 pg/μL）。封闭离心芯片实现定量RPA-CRISPR（6.08拷贝/μL）。

**4.2. Environmental Pathogen and One Health Biosurveillance**
Siam/iCASA卡盒用于SARS-CoV-2气溶胶监测（25分钟，20拷贝/mL）。密封离心微流控芯片检测流感亚型（25分钟，101-102拷贝/mL）。表面工程μPAD自动检测非洲猪瘟病毒（ASFV）和伪狂犬病病毒（PRV）（10拷贝/μL，11.5-14.5分钟）。RPA-CRISPR/Cas12a结合催化发夹组装（CHA）检测鸭瘟病毒（0.02 fg/μL，40分钟）。箔基电化学基因传感器检测vanB万古霉素耐药基因（<50 nM）。RPA-CRISPR/Cas12a检测转基因大豆（10拷贝/μL，60分钟）。

**4.3. Emerging Trends in Environmental RPA Biosurveillance**
环境RPA诊断正趋向样品到答案平台、CRISPR辅助特异性、自主化和联网监测。无线传输、云分析、智能手机接口和AI辅助解释可能将孤立测试转化为空间分辨预警系统。RPA与环境DNA（eDNA）分析、同一健康监测和智能传感的融合有望实现连续风险追踪。

**4.4. Challenges and Future Perspectives in Environmental Monitoring**
环境样品（空气、水、土壤等）中目标稀少且含抑制剂，采样是核心。定量仍困难，需校准策略和内参。封闭卡盒和防污染工作流至关重要。试剂需耐受温度变化和运输。未来平台需结合坚固采样、抑制剂耐受制备、稳定试剂和定量读出。

**5. Intelligent, Digital, and AI-Enabled RPA Diagnostic Systems**
现场部署依赖可靠解释、自动化、多路复用、定量和实时数据处理。RPA平台嵌入数字传感、自动图像分析、云连接和机器学习，减少操作员依赖，支持智能诊断网络。

**5.1. Smartphone- and AI-Assisted RPA Diagnostics**
智能手机辅助微流控RPA检测鼠伤寒沙门氏菌（30分钟，1.0×10² 拷贝/μL）。密封微流控芯片用于HLA-B*58:01基因分型（25分钟，10拷贝/μL）。R-CHIP手驱动RPA-CRISPR微流控平台检测高危HPV（1小时，10^-17-10^-18 M，ResNet-18分类器）。

**5.2. Digital, Quantitative, and Automated Microfluidic RPA Platforms**
数字RPA格式：光固化聚硅氧烷腔室阵列芯片（1拷贝/μL）；光可裂解笼式引物实现数字RPA（5-3×10⁴ 拷贝/μL，40分钟）；液滴计数RPA-CRISPR/Cas12a检测甲基化FOXD3（5拷贝/μL，0.01%甲基化）。自动化平台：一次性卡盒检测呼吸道病毒（35-50分钟，1-100拷贝/μL）；开源机器人自动化RPA检测脑膜炎奈瑟菌（120分钟）。手驱动空间编码微流控结合RPA-CRISPR/LFA和AI移动解释（1×10^-18 M，98.57%准确率）。

**5.3. Connected RPA Diagnostics and Intelligent Healthcare Systems**
RPA诊断的下一阶段依赖于与数字健康系统的连接。云计算、无线通信和数据分析将微流控和纸基格式与医疗和监测基础设施相连，支持实时疫情监测、热点映射和资源分配。AI、数字微流控、CRISPR识别和云连接的融合将RPA系统转变为智能诊断平台。

**5.4. Challenges and Future Perspectives in Intelligent RPA Diagnostic Systems**
图像解释依赖照明、相机光学等条件，AI模型需代表性训练数据。数字和自动RPA平台面临工程挑战：液滴填充均匀、密封、同步启动和低拷贝区分。自动化引入新错误点（阀门卡滞、气泡等）。连接诊断需考虑隐私、网络安全和监管验证。实际采纳取决于成本、可重复性和用户界面。

**6. Conclusions and Future Outlook**
微流控和纸基RPA技术已将等温扩增发展为可部署的分子检测工作流，涵盖生物医学、食品安全、环境监测和公共卫生。CRISPR识别、数字分区、电化学界面和智能手机成像扩展了应用空间。主要障碍包括样品制备、多路扩增平衡、定量可靠性和制造一致性。试剂稳定性（冻干）、制造公差和监管验证是关键。机器学习辅助分析、云报告和同一健康框架将推动平台向连续、智能和联网诊断发展。未来重点是将技术融合转化为可重复的设备、验证的工作流和实施路径。