考虑边界裕度、虹膜与瞳孔的眼睛辅助线改进方法用于肖像画学习辅助系统

《Information》：An Improved Eye Auxiliary Line Considering Boundary Margin, Iris, and Pupil for Portrait Drawing Learning Assistance System

　　

当前研究主要集中于治疗后耐药性，而顺铂对肿瘤-免疫相互作用的即时影响仍知之甚少。研究人员将肿瘤细胞与免疫细胞共培养以评估免疫细胞激活情况。通过TCGA数据库分析了RAB27A/B与非小细胞肺癌（NSCLC）中CD274表达水平的相关性。利用TIMER2.0评估了RAB27A/B与肿瘤微环境的关系。顺铂显著提高PD-L1 mRNA水平和表面蛋白表达，分别通过qPCR、流式细胞术和共聚焦显微镜检测。在共培养实验中，顺铂诱导的细胞表面PD-L1蛋白水平抑制了Jurkat T细胞的激活。顺铂还上调了与外泌体分泌相关的基因，并增加了总外泌体颗粒计数及每个细胞的外泌体分泌量。使用外泌体释放抑制剂GW4869预处理可显著增强HCC827细胞对顺铂的敏感性。GW4869降低了细胞内RAB27A/B和EV PD-L1水平，但未改变细胞PD-L1表达。生物信息学分析进一步揭示，高RAB27A/B表达与NSCLC患者5年生存率差相关，且与CD8⁺ T细胞激活负相关，而与癌症相关成纤维细胞正相关。RAB27A和RAB27B基因表达水平均与CD274正相关。结论：RAB27A和RAB27B可能是调节顺铂诱导的外泌体PD-L1水平及肿瘤微环境的关键蛋白。

**论文解读文章**

**研究背景**
肺癌是全球癌症相关死亡的首要原因，非小细胞肺癌（NSCLC）约占85%。近年来，靶向治疗、免疫检查点抑制剂（ICIs）及化学免疫疗法改善了NSCLC预后，但约50%患者对化学免疫治疗无应答。顺铂作为铂类化疗药物是肺癌治疗的基石，但超过60%患者最终产生耐药性，并伴有肾毒性等副作用。程序性死亡配体1（PD-L1）在肿瘤细胞表面表达，与活化T细胞上的程序性死亡受体1（PD-1）结合，抑制T细胞增殖和效应功能。顺铂可通过JAK/STAT和NF-κB等DNA损伤反应通路上调PD-L1表达，这可能促进免疫逃逸。外泌体是直径30-150 nm的脂双层结构，携带PD-L1等分子。RAB27A和RAB27B是调控外泌体与细胞膜融合及分泌的关键蛋白，在乳腺癌、黑色素瘤中过表达与疾病进展相关。然而，在NSCLC中顺铂对外泌体PD-L1的即时影响、RAB27A/B与顺铂敏感性及免疫浸润的关系尚不明确。本研究旨在阐明顺铂暴露如何影响NSCLC细胞的外泌体释放和外泌体PD-L1表达，及其是否降低免疫治疗响应性。

**研究概述**
研究人员利用NSCLC细胞系（HCC827、A549、H1299）和Jurkat T细胞共培养模型，结合TCGA数据库和TIMER2.0生物信息学分析，发现顺铂处理显著上调细胞表面PD-L1及外泌体PD-L1蛋白水平，促进外泌体分泌；RAB27A/B高表达与NSCLC患者较差5年生存率及CD8⁺ T细胞抑制相关；使用外泌体释放抑制剂GW4869可降低细胞内RAB27A/B和外泌体PD-L1水平，增强顺铂敏感性。该研究发表在《Information》期刊。

**关键技术与方法**
研究人员主要采用以下技术方法：
- 细胞培养与共培养模型：使用HCC827、A549、H1299人肺癌细胞系（来源：BCRC和ATCC）与Jurkat T细胞共培养，评估免疫激活。
- 外泌体分离与表征：通过差速超速离心（100,000×g）纯化外泌体，采用纳米颗粒追踪分析（NTA）测定粒径和数量，透射电子显微镜（TEM）观察形态，免疫印迹检测外泌体标志物（CD9、CD81、CD63、ALIX）。
- 流式细胞术：检测细胞表面PD-L1表达（FITC标记抗体）。
- 酶联免疫吸附试验（ELISA）：检测Jurkat T细胞释放的IL-2。
- 定量逆转录PCR（qRT-PCR）：分析CD274 mRNA表达水平。
- 共聚焦显微镜：观察PD-L1细胞定位。
- 生物信息学分析：利用TCGA数据库分析RAB27A/B与CD274表达相关性，TIMER2.0评估免疫微环境特征，Kaplan-Meier生存分析。

**研究结果**

**3.1 顺铂对NSCLC细胞的细胞毒性**
通过CCK-8实验发现，顺铂（12.5-50 μM）显著降低HCC827、A549和H1299细胞活力，24小时IC50值分别为16.99、16.44和61.27 μM，表明低转移细胞系（A549、HCC827）对顺铂更敏感。

**3.2 RAB27A/B表达与免疫微环境及顺铂耐药性的关联**
对顺铂耐药相关基因进行功能富集分析，发现耐药基因主要富集于T细胞增殖负调控、T细胞分化负调控及细胞衰老等通路。在肺鳞癌（LUSC）中，RAB27A表达与肿瘤纯度、CD8⁺ T细胞和CD4⁺ Th1细胞负相关，而与免疫评分、调节性T细胞（Tregs）、癌症相关成纤维细胞（CAFs）及CD274（PD-L1）正相关。在肺腺癌（LUAD）中，RAB27B表现类似趋势。表明RAB27A/B可能桥接肿瘤免疫微环境与耐药性。

**3.3 高RAB27A/B表达与NSCLC低5年生存率及CD274表达相关**
TCGA数据显示，LUAD肿瘤组织中RAB27B mRNA显著高于正常组织。Kaplan-Meier分析显示，高RAB27A表达的LUSC患者5年生存率38%（低表达55%），中位生存期40 vs. 64个月；高RAB27B表达的LUAD患者5年生存率27%（低表达47%），中位生存期39 vs. 55个月。Pearson相关分析表明，在LUAD和LUSC中，RAB27A/B与CD274均呈正相关。

**3.4 顺铂处理增强细胞和外泌体PD-L1水平**
免疫印迹显示，顺铂（12.5 μM和25 μM）处理H1299和HCC827细胞24小时后PD-L1蛋白增加。qRT-PCR表明PD-L1 mRNA在顺铂处理后4、8、16小时升高。流式细胞术和共聚焦显微镜证实顺铂增加细胞表面PD-L1荧光强度。Jurkat T细胞与HCC827共培养实验中，顺铂处理组IL-2释放显著降低，提示顺铂诱导的PD-L1抑制T细胞活性。

**3.5 顺铂促进外泌体释放和外泌体PD-L1**
NTA分析显示顺铂处理组外泌体总颗粒数和每细胞分泌颗粒数增加。TEM观察到典型外泌体形态。免疫印迹表明顺铂处理组外泌体中CD9、CD81、TSG101和外泌体PD-L1蛋白表达显著升高（约2倍）。

**3.6 抑制外泌体释放增强顺铂对细胞增殖的抑制作用**
Jurkat T细胞与顺铂处理HCC827来源外泌体共培养后IL-2释放显著降低。GW4869（10 μM）与顺铂联用使细胞活力抑制率从9%升至22%。细胞裂解液中，GW4869联合顺铂组RAB27A/B蛋白下降，但PD-L1不变；外泌体裂解液中，CD63、CD9、CD81、ALIX及EV-PD-L1均下降。表明抑制外泌体分泌可增强顺铂敏感性，且下调RAB27A/B和EV-PD-L1。

**讨论与结论**
研究证实顺铂急性处理上调NSCLC细胞PD-L1和外泌体PD-L1，并促进外泌体分泌。RAB27A/B高表达分别与LUSC和LUAD中细胞毒性T细胞活化抑制及低生存率相关。GW4869抑制外泌体释放后，顺铂诱导的外泌体PD-L1升高被消除，且细胞内PD-L1水平不变，提示该联合策略可为免疫检查点抑制剂治疗创造有利微环境。结论指出，外泌体PD-L1播散是化疗诱导免疫逃逸的潜在新机制，可能解释化学免疫治疗的异质性反应；研究支持将外泌体PD-L1作为实时液体活检生物标志物，并将外泌体生物发生作为增强化学免疫治疗效力的治疗靶点。