一种靶向神经氨酸酶的纳米抗体提供对乙型流感病毒的广泛保护

《Journal of Virology》：A neuraminidase-targeted nanobody confers broad protection against influenza B virus

　　

乙型流感病毒（IBV）具有抗原多样性，显著增加了每年流感相关疾病的负担，对全球公共卫生和经济造成重大影响。在本研究中，研究人员聚焦于IBV的神经氨酸酶（NA），用四聚体IBV NA免疫一只羊驼，并鉴定出一系列纳米抗体，这些抗体在CDR3中具有共同的“DYR”基序，对IBV的多种NA表现出广泛抑制活性。其中，最有效的VHH5广泛抑制来自祖先株、B/Yamagata/16/88-like和B/Victoria/2/87-like谱系的多个代表性毒株的NA。此外，将VHH5与人免疫球蛋白G1 Fc结构域融合，显著提高了其体外抗病毒效力，50%抑制浓度（IC₅₀）在低纳摩尔范围内。结构建模和分子动力学模拟揭示，VHH5延伸的CDR3环中的“DYR”基序穿透催化口袋，与IBV NA高度保守的催化位点结合。对预测界面的实验诱变分析进一步支持了这一结合模型。此外，VHH5-Fc在预防和治疗两种情况下保护小鼠免受高剂量IBV-2024病毒的致命攻击。研究人员的发现强调了Fc融合的VHH5抗体在控制乙型流感病毒感染中的潜力。

**论文解读：靶向神经氨酸酶的纳米抗体VHH5-Fc对乙型流感病毒的广泛保护作用**

**研究背景与问题**
季节性流感病毒是全球流行的呼吸道病原体，每年造成约10亿人感染和30万至60万例呼吸道相关死亡，其中乙型流感病毒（IBV）约占20%~30%的死亡病例。IBV自1940年首次发现后，已分化为两个抗原和遗传上截然不同的谱系：B/Yamagata/16/88-like和B/Victoria/2/87-like。自1983年以来，这两个谱系在全球共同流行，在2000年至2018年间约占人类流感病例的25%。值得注意的是，自2020年起，B/Yamagata/16/88-like谱系病毒在全球未被检测到，表明IBV流行病学发生了显著变化。
虽然IBV感染通常比甲型流感病毒（IAV）症状轻，但在住院患者中，尤其是儿童和老年人，IBV感染与更严重的后果相关。一项2004年至2013年的队列研究显示，≤16岁住院IBV患者死亡率高于IAV感染者。此外，≥10岁健康儿童感染IBV后进入重症监护病房的风险显著高于IAV感染者。
血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）是流感病毒的两个主要糖蛋白，在病毒感染周期中起关键作用。目前许可的季节性流感疫苗主要靶向HA，但有效性为10%~60%，效果欠佳。相比之下，NA进化更慢，具有高度保守的酶活性位点，是开发疫苗和抗病毒药物的重要靶点。自2010年以来，几种NA抑制剂（如奥司他韦、帕拉米韦和扎那米韦）已被广泛使用，但其对IBV的临床效力通常低于对IAV。此外，IBV中出现的各种NA突变已导致对现有NA抑制剂（NAIs）的显著耐药性，阻碍了IBV的预防和治疗。
骆驼科动物可变重链结构域抗体（称为纳米抗体）具有体积小、互补决定区3（CDR3）延伸且灵活的特点，可进入隐蔽或构象受限的表位，而常规免疫球蛋白G（IgG）抗体通常无法触及这些表位。鉴于IBV NA口袋深而窄，研究人员推测纳米抗体的延伸CDR3可能具有更好的酶活性位点可及性。因此，本研究旨在鉴定靶向IBV NA保守活性位点、具有广泛抑制活性的纳米抗体，并评估其作为治疗候选药物的潜力。
本论文发表在《Journal of Virology》。

**主要关键的技术方法**
研究人员采用重组IBV NA蛋白（B/Colorado/06/2017，B/Victoria/2/87-like谱系）免疫一只3岁雌性羊驼，构建噬菌体展示VHH文库。通过固相生物淘选筛选NA特异性纳米抗体，利用酶联免疫吸附试验（ELISA）鉴定阳性克隆。结合动力学采用表面等离子体共振（SPR）测定。NA酶活抑制试验使用MUNANA底物。采用蛋白对接和分子动力学（MD）模拟预测结合模式，并通过定点诱变验证。体内保护实验使用雌性BALB/c小鼠（7~8周龄），经鼻内高剂量（25× mLD₅₀）B/Anhui/01/2024病毒攻毒，在预防（攻毒前24小时）和治疗（攻毒后24小时）模式下腹腔注射VHH5-Fc。病毒株来源：B/Anhui/01/2024分离自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所收集的成人鼻拭子；B/Yamagata/16/1988来自中国疾病预防控制中心国家流感中心。

**研究结果**
**Identification of potent nanobodies targeting IBV NA from an immune VHH library**
通过免疫羊驼构建VHH文库，经三轮生物淘选后，随机挑选48个克隆进行ELISA筛选，获得20个结合克隆，测序鉴定出6个独特序列（VHH2、VHH4、VHH5、VHH6、VHH8、VHH10）。Western blot和SDS-PAGE确认表达纯度高，证明成功产生靶向IBV NA的纳米抗体。

**Binding activity and cross-lineage inhibitory effects of nanobodies against influenza B virus NA**
ELISA显示六种VHH均与rNA-FluB强结合。MUNANA试验表明，所有VHH对来自B/Victoria/2/87-like（2017）和B/Yamagata/16/88-like（2017）的NA病毒样颗粒（NA-VLPs）均有不同程度抑制，其中VHH5抑制活性最强。SPR测得VHH5与rNA-FluB的表观结合亲和力（KDapp）为3.03 nM。剂量反应MUNANA试验中，VHH5对祖先株、B/Yamagata/16/88-like（1988）及B/Victoria/2/87-like（2019、2021、2024）的NA均呈浓度依赖性抑制，IC₅₀在13.6至48.0 nM之间，证明其广泛抑制活性。

**Engineering VHH5 into Fc-fusion formats enhances its NA inhibitory activity and antiviral efficacy**
将VHH5改造为双价（Bi-VHH5）和Fc融合（VHH5-Fc）形式。SDS-PAGE确认分子量。噬斑减少试验表明，1 μM时Bi-VHH5和VHH5-Fc有效抑制噬斑形成，单体VHH5仅部分抑制。MUNANA试验中，Bi-VHH5和VHH5-Fc的IC₅₀约为VHH5的两倍。VHH5-Fc对B/Lee/1940（祖先）、B/Yamagata/16/88-like（1988和2017）及B/Victoria/2/87-like（2019、2021、2024）的NA均呈纳摩尔级抑制，且对携带NAI耐药突变E117A或H134N的NA-VLPs仍保持抑制活性。

**Protective efficacy of VHH5-Fc against seasonal influenza B virus infection in vivo**
在预防模型中，30、50或100 μg VHH5-Fc处理的BALB/c小鼠（n=12~14）在25× mLD₅₀攻毒后全部存活，仅在第1~3天出现短暂体重下降（~10%），第4天恢复，而IgG对照组体重持续下降并高死亡率。在治疗模型中，100 μg和30 μg剂量组小鼠全部存活，50 μg组存活率83%。证明VHH5-Fc在预防和治疗条件下均能提供强效保护。

**Structural basis underpinning VHH5’s potent inhibition of NA**
蛋白对接和MD模拟预测了5种候选结合姿势。时间依赖性均方根偏差（RMSD）分析和分子力学/广义玻恩表面积（MM/GBSA）结合自由能计算确定姿势3为最优结合模式。在该模式下，VHH5的CDR3环深入NA催化口袋，其Y98、D100、Y100a和R100b残基分别与NA的E373、R292、T146和D149形成氢键。MD模拟显示这些氢键形成频率高且能量贡献大。ELISA结合分析表明，VHH5突变为D100A、Y100aA、R100bA或Y98A后结合力显著降低；而NA的R292A和D149A突变也降低了与VHH5的结合，证实了预测的相互作用界面。此外，VHH5的结合模式与先前报道的VHH525不同，VHH5以倾斜姿势（姿势3）更深入插入口袋。

**Evolutionary diversification of IBV lineages and conserved neuraminidase residues targeted by VHH5**
系统发育分析（邻接法）显示测试毒株覆盖了祖先、B/Yamagata/16/88-like和B/Victoria/2/87-like三大进化分支。NA多序列比对表明，VHH5接触的四个残基（E373、R292、T146、D149）在B/Victoria/2/87-like谱系中完全保守，仅在部分B/Yamagata/16/88-like和祖先株中第373位有单个变异，解释了VHH5的跨谱系抑制活性。

**讨论总结与结论**
本研究从免疫羊驼VHH文库中分离并鉴定了一系列抑制IBV NA活性的纳米抗体，其中VHH5活性最强。Fc融合后的VHH5-Fc对测试的IBV NAs（包括祖先、B/Yamagata/16/88-like、B/Victoria/2/87-like及NAI耐药突变株）保持纳摩尔级抑制活性。在高剂量（25× mLD₅₀）B/Anhui/01/2024致死攻毒小鼠模型中，30或100 μg VHH5-Fc在预防和治疗模式下均提供完全保护。结构模拟表明，VHH5通过其延伸CDR3中的“DYR”基序嵌入NA催化口袋，与保守残基形成稳定相互作用，阻断底物进入。尽管与先前报道的VHH525均利用“DYR”基序，但两者结合取向不同，VHH5以倾斜姿势更深入插入。IBV NA的系统发育分析显示B/Victoria/2/87-like谱系持续分化，而VHH5靶向的NA活性位点残基高度保守，表明NA靶向策略可应对HA进化导致的免疫逃逸。
研究人员认为，VHH5-Fc作为广谱抗IBV治疗候选药物具有潜力。研究局限性包括缺乏高分辨率复合物结构（如冷冻电镜或X射线晶体学）、未进行逃逸突变体选择以及未评估对病毒传播的影响。未来研究需优化免疫剂量和方案、探索双特异性或吸入型制剂等。
结论：研究人员鉴定了一系列靶向IBV NA催化位点、具有广泛抑制活性的纳米抗体，其中VHH5抑制效力最强。VHH5-Fc抗体在体外和体内模型中均显示出显著抗病毒效力。机制研究揭示VHH5通过其CDR3区域的高度保守“DYR”基序结合NA活性位点的保守残基，从而有效抑制多个抗原性不同的IBV毒株。VHH5的发现扩展了抗IBV NA抗体库，支持进一步开发基于纳米抗体的靶向IBV抗病毒疗法。