犬特异性神经酰胺复合物(Canine-Specific Ceramide Complex)的优化及其对犬皮肤体外(In Vitro)与体内(In Vivo)作用评价

《Animals》：Optimization of a Canine-Specific Ceramide Complex and Evaluation of Its Effects on In Vitro and In Vivo Canine Skin

　　

摘要：犬特应性皮炎(Canine Atopic Dermatitis, AD)患犬皮肤中存在神经酰胺(Ceramide, CER)谱异常，但CER各亚类对犬角质形成细胞的具体影响尚不清楚。本研究旨在优化CER复合物，并利用犬表皮角质形成细胞祖细胞(Canine Epidermal Keratinocyte Progenitor, CPEK)及重组犬表皮(Reconstructed Canine Epidermis, RCE)模型评估其对细胞因子表达、CER合成及皮肤屏障形成的影响。在测试的多种CER组合中，仅CER [NS]与CER [EOP]的混合物能显著降低中间型葡萄球菌(Staphylococcus pseudintermedius)刺激的CPEK细胞中促炎细胞因子mRNA水平。进一步优化发现，CER [NS]与CER [EOP]按重量比4:1组成的犬特异性神经酰胺(canine-specific Ceramide, cCER)复合物，可明显下调CCL17与CCL22 mRNA表达，同时上调角蛋白10(Keratin 10, KRT10)、神经酰胺合酶3(Ceramide Synthase 3, CERS3)、神经酰胺合酶4(CERS4)及从头(de novo)与补救(salvage)CER生物合成通路相关酶的表达。在RCE模型中，cCER处理改善了角质层(stratum corneum, SC)组织结构，并增加兜甲蛋白(Loricrin, LOR)、CERS3及CER的表达。在体实验显示，犬皮肤局部应用cCER可加速皮肤屏障修复并改善被毛状态。研究结果表明，CER [NS]/[EOP]混合物因具有抗炎及增强皮肤屏障的双重效应，有望成为犬特应性皮炎辅助治疗的新选择。

论文解读：犬特异性神经酰胺复合物的优化及其对犬皮肤屏障与炎症的影响

研究背景与目的

犬特应性皮炎(Canine Atopic Dermatitis, AD)是一种慢性、复发性过敏性皮肤病，其特征为持续性瘙痒、皮肤炎症及皮肤屏障功能障碍。神经酰胺(Ceramide, CER)是表皮角质层细胞间脂质的主要成分（约占50%），对防止经表皮水分丢失(Transepidermal Water Loss, TEWL)及抵御外来病原体、过敏原至关重要。既往研究表明，犬AD及脂溢性皮肤病患犬皮肤中特定CER亚类显著减少，尤以CER [EOP]和CER [EOS]下降最为明显；而健康犬皮肤以CER [NS]为主要成分，这与人皮肤以CER [NP]为主的组成存在差异。目前市售含CER的宠物护肤产品多沿用基于人皮肤优化的配方（如CER [NP]、CER [AP]），未必契合犬皮肤生理特征。因此，研究人员假设：补充健康犬表皮主要成分CER [NS]，联合AD患犬显著缺失的CER [EOP]或CER [EOS]，可对犬皮肤产生抗炎及促进屏障修复的益处。本研究通过体外细胞与组织模型及健康犬在体实验，筛选并优化犬特异性CER复合物(cCER)，评估其对炎症因子表达、CER自身合成酶、表皮分化标志物及皮肤屏障恢复的作用。该论文发表于《Animals》。

主要关键技术方法

研究人员采用犬表皮角质形成细胞祖细胞(CPEK)体外培养体系，以中间型葡萄球菌(Staphylococcus pseudintermedius)共培养诱导炎症模型，通过qRT-PCR检测促炎细胞因子(CCL17/CCL22)、角蛋白10(KRT10)、神经酰胺合酶(CERS3/CERS4)及CER从头与补救合成通路酶(ASAH1、SPHK1/2、SGPP1/2、SPTLC2、KDSR、DEGS1)的mRNA表达，并用CCK-8法检测细胞毒性。利用定制重组犬表皮(Reconstructed Canine Epidermis, RCE)模型进行免疫组化(IHC)分析兜甲蛋白(LOR)、CERS3及CER的表达，并以TLR2/TLR1激动剂Pam3CSK4诱导RCE炎症/屏障破坏模型评估cCER的保护作用。在体实验选用2只健康去势雄性比格犬(Beagle)，于腹股沟区行20次胶带剥离(Tape Stripping)人为破坏皮肤屏障，每日外用含0.2% cCER的基质制剂，连续4天，测定TEWL计算屏障恢复率；收集被毛行扫描电镜(SEM)观察毛小皮、尼罗红(Nile Red)染色测脂质含量及抗KRT31免疫荧光检测角蛋白表达。

研究结果

3.1. Effects of CER Mixtures on Expression of Proinflammatory Cytokines（CER混合物对促炎细胞因子表达的影响）

研究人员将CPEK细胞与S. pseudintermedius共培养后，检测胸腺活化调节趋化因子(CCL17/TARC)和巨噬细胞衍生趋化因子(CCL22/MDC)的mRNA水平。结果发现仅CER [NS]+CER [EOP]组合能显著下调CCL17与CCL22 mRNA表达，效果与阳性对照地塞米松(Dexamethasone, 1 μM)相当；其他CER组合（含CER [EOS]参与的组合）均无此抑制作用。

3.2. Optimization of the Combination Ratio: Mixture of CER [NS] and [EOP]（CER [NS]与[EOP]组合比例优化）

研究人员测试CER [NS]:CER [EOP]不同质量比(1:1、1:2、2:1、4:1等)对基因表达的影响。各比例均可降低CCL17/CCL22，但仅4:1比例同时具备以下特征：显著抑制促炎细胞因子mRNA、上调KRT10 mRNA、上调CERS3及CERS4 mRNA。故确定犬特异性神经酰胺(cCER)为CER [NS]:CER [EOP]=4:1(w/w)，总浓度10 μg/mL（8 μg/mL CER [NS]+2 μg/mL CER [EOP]）。

3.3. Cytotoxicity of cCER in CPEK Cells（cCER对CPEK细胞的细胞毒性）

研究人员以CCK-8法检测0.1–100 μg/mL cCER处理24 h后CPEK细胞存活率，各浓度组与未处理对照组相比均无显著差异，表明在此浓度范围内cCER对犬角质形成细胞无细胞毒性。

3.4. Effect of the cCER on the Expression of CER Synthesis Pathway Enzymes（cCER对CER合成通路酶表达的影响）

研究人员检测cCER处理CPEK细胞后CER代谢关键酶的表达。结果显示：补救(salvage)通路中酸性神经酰胺酶(ASAH1)、鞘氨醇激酶(SPHK1、SPHK2)、鞘氨醇-1-磷酸磷酸酶(SGPP1、SGPP2)的mRNA显著上调，效果与鞘氨醇(Sphingosine, 1 μM)阳性对照相当；从头(de novo)合成通路中丝氨酸棕榈酰转移酶长链亚基2(SPTLC2)、3-酮二氢鞘氨醇还原酶(KDSR)、二氢神经酰胺去饱和酶-1(DEGS1)及CERS3、CERS4也显著上调，效果与氯化钙(1.2 mM Ca²⁺)阳性对照相当。提示cCER可促进犬角质形成细胞内源性CER的生物合成。

3.5. Effects of the cCER on RCE（cCER对重组犬表皮模型的影响）

研究人员对RCE模型进行IHC染色，未处理RCE可表达KRT10、LOR、CERS3及CER，模式与犬正常皮肤相似。cCER处理后上述分化标志物和CER的表达积分光密度(IOD)显著增加，角质层排列更规整。以Pam3CSK4刺激RCE引起角质层紊乱及海绵水肿(spongiosis)，而cCER共处理可减轻角质层变形并消除海绵水肿，组织学表现接近未刺激组。

3.6. Effects on the Recovery of Skin Barrier Function and Hair Conditions of Dogs（cCER对犬皮肤屏障功能恢复及被毛状态的影响）

研究人员在胶带剥离破坏屏障后局部应用含0.2% cCER制剂，第1、2天cCER处理侧TEWL恢复率显著高于对照组（即屏障修复更快）。连续应用4天后采集被毛，扫描电镜显示cCER处理组毛小皮(cuticle)排列更整齐；尼罗红荧光强度升高提示毛干脂质含量增加；抗KRT31免疫荧光强度亦升高，定量分析与对照组相比差异显著(p<0.05或p<0.005)。

讨论与结论总结

研究人员指出，犬AD皮肤屏障受损常伴SC细胞间脂质CER谱改变，长链CER对层状结构稳定性尤为重要。本研究中优化的cCER（CER [NS]/CER [EOP]=4:1 w/w）可降低S. pseudintermedius诱导的CCL17与CCL22（Th2型炎症关键趋化因子），上调表皮分化标志物KRT10和LOR，激活CER补救与从头合成通路酶从而促进内源性CER生成，在RCE中改善SC组织并抵抗TLR2介导的炎症损伤，在健康犬中加速屏障修复并改善被毛脂质与角蛋白。CER [NS]与CER [EOP]头基间氢键及长碳链间范德华力可能是其协同增效的机制基础。研究局限包括炎症与合成酶指标仅检测mRNA水平、未分析cCER诱导产生的具体CER亚类谱、在体实验为健康犬初步试点(n=2)尚不能直接外推至AD患犬。

结论翻译（取自原文Conclusions浓缩）：

本研究成功优化出由CER [NS]与CER [EOP]按4:1质量比组成的犬特异性神经酰胺复合物(cCER)。该cCER在S. pseudintermedius刺激的CPEK细胞中可抑制CCL17与CCL22等促炎细胞因子表达，同时上调表皮分化(KRT10)及CER生物合成酶(CERS3、CERS4及补救/从头通路酶)的表达。RCE模型与犬在体实验进一步证实，cCER可增强角质层有序性、加速皮肤屏障修复并改善被毛状态。综上，CER [NS]/CER [EOP]混合物是具抗炎和屏障增强双重作用的候选外用辅料，有望用于犬特应性皮炎的辅助治疗，其临床疗效与安全性尚需针对AD患犬开展大样本试验验证。