利用内部转录间隔区测序技术对瓜尼卡州立森林洞穴中真菌群落的特征分析

《Microbiology Resource Announcements》：Characterization of fungal communities in Guánica State Forest caves utilizing internal transcribed spacer sequencing

　　

摘要

洞穴是地下极端生态系统，孕育着多种多样的微生物群落。本研究通过对瓜尼卡州立森林内的四个洞穴以及一个洞穴池塘淤泥样本进行内转录间隔区测序，以探究其中的真菌群落。这一多样性分析结果为研究波多黎各洞穴系统中的真菌种群提供了基础。

声明

洞穴是营养贫乏、环境黑暗的生态系统，其温度波动较大（1，2）。尽管如此，这些地方仍存在多种微生物群落，它们参与营养物质循环，并能产生具有生物医学价值的化合物（2）。真菌有助于分解作用、矿物风化，同时也是寻找新型生物活性化合物的重要来源（3，4）。波多黎各南部的洞穴，尤其是瓜尼卡州立森林中的洞穴，其微生物研究还相对不足。该森林中最大的洞穴系统——蝙蝠洞，拥有相互连接的洞室和多个入口（5）。其中有一个名为卡里塔洞的入口，那里有蝙蝠粪便，使得池塘淤泥变得肥沃，可能孕育出独特的真菌群落（5）。为了了解这些微生物群落的多样性，我们对它们进行了分类分析。研究共采集了瓜尼卡州立森林内的四个洞穴和一个池塘淤泥样本（图1；表1）。从这些洞穴中采集了30克含有蝙蝠粪便的表层土壤和池塘淤泥，将其置于无菌的Whirl-Pak袋中，保存在4°C条件下，直至进行DNA提取。DNA提取时，将每份样本的10克悬浮在含有0.02克溶菌酶的20毫升Z缓冲液中。通过反复的冻融处理破坏细胞结构，然后在65°C下使用2.25毫升十二烷基硫酸钠和1.5毫升胍异硫氰酸酯处理2小时以裂解细胞。将裂解液通过离心去除杂质，再用等体积的氯仿进行提取，最后在-20°C下用一体积的异丙醇使水相沉淀，过夜。得到的DNA沉淀物经过离心，用70%乙醇洗涤，风干后重新悬浮在无菌水中，再保存在-80°C条件下（6–8）。通过凝胶电泳分离出长度不超过25 kb的DNA片段，然后按照制造商的说明使用β-琼脂糖酶I进行纯化（9）。纯化的DNA被送至美国德克萨斯州沙洛阿特的Molecular Research DNA Laboratory实验室，使用bTEFAP Illumina 20k内置ITS1-2多样性检测方法进行内转录间隔区测序（10）。PCR扩增时，首先在95°C下变性5分钟，接着进行30轮循环：在95°C下变性30秒，然后在53°C下退火40秒，最后在72°C下延伸1分钟，最后再在72°C下延伸10分钟。测序工作是在Illumina MiSeq仪器上进行的，采用2×300 bp的配对末端测序方式。原始序列数据被导入到Python 3.10.14环境下的QIIME 2 2026.1版本中，作为已去重处理的配对末端读段，随后使用ITSxpress 2.1.4版本对数据进行修剪（12）。之后使用DADA2对数据去噪，无需进一步修剪或截断（13）。除非另有说明，所有生物信息学分析均采用默认参数。代表性的序列则使用2025年2月19日为QIIME 2 2026.1版本发布的UNITE 10.0版动态真菌分类器进行分类（14）。在MUR、CRT、GEN、NEG和GUA这五个采样点中，有超过200万个非嵌合体读段被保留下来，保留率为79.21%（平均值，表1）。共鉴定出1,720个单核基因组序列。未分类的真菌占所有读段的21.56%。在已分类的真菌类群中，球壳孢目（24.83%）、欧文氏菌目（13.27%）、枝孢菌目（6.13%）和多孔菌目（5.70%）的丰度最高，这表明不同采样点间的真菌分类存在显著差异（图1）。

图1

图1 波多黎各四个洞穴和一个池塘中真菌群落的目级相对丰度。（A）条形图显示了各样本中真菌目的相对丰度。（B）瓜尼卡州立森林的地图，标出了样本所在位置。该地图由ángel M. Nieves-Rivera绘制。

表1

表1 样本编号、样本详细信息以及DADA2分析结果

采样洞穴	样本编号	坐标	采集日期	原始输入读段数	通过过滤的输入读段比例	去噪后的读段数	非嵌合体读段数	非嵌合体读段比例
蝙蝠洞	MUR	北纬17° 57′34.5″，西经66° 50′58.6″	2025年5月17日	475,324	97.5%	459,975	321,463	69.63%
卡里塔洞	CRT	北纬17° 57′16″，西经66° 50′54″	2025年5月17日	523,073	94.72%	493,996	397,131	75.92%
黑地质纳洞	GEN	北纬17° 57′19″，西经66° 51′10″	2025年6月28日	590,545	95.87%	564,651	480,654	81.39%
黑洞	NEG	北纬17° 58′11″，西经66° 52′35″	2025年6月28日	676,466	96.06%	647,747	605,844	89.56%
蝙蝠粪便湖	GUA	北纬17° 57′37″，西经66° 51′08″	2025年5月17日	362,443	96.76%	348,842	276,427	76.27%

致谢

我们感谢一些洞穴探险团体（西部洞穴探险队以及Norman Veve洞穴探险公司）以及Walter Díaz Rodríguez在洞穴采样地点确定和后勤保障方面的帮助。同时，也要感谢Tesia Lin在文章审阅和编辑工作中的辛勤付出。