《Bioactive Materials》：Injectable microsphere-based delivery strategies for stem cells and their derivatives in tissue regeneration
组织和器官损伤、退变及功能丧失已成为日益严峻的全球健康挑战，人口老龄化及现有临床干预措施的局限性加剧了这一挑战。再生医学通过递送干细胞及其生物活性衍生物（特别是外泌体（exosomes））以恢复组织功能，提供了一种有前景的替代方案。然而，直接施用这些治疗性制剂面临着显著障碍，包括低驻留率、快速清除以及较差的时空控制能力。基于可注射微球的递送系统已发展成为一种通用且微创的平台，用以克服这些局限性。本综述系统地概述了微球介导的递送干细胞及其衍生物策略在多种组织类型（包括骨、软骨、神经、皮肤、牙髓、心脏和肺）中的最新进展。研究人员严格评估了天然和合成聚合物的设计原理、微流控（microfluidics）和电喷雾（electrospray）等制备技术，以及微球在提供三维（3D）支架、免疫保护和持续释放方面的生物学功能。此外，研究人员重点阐述了新兴前沿领域，包括递送凋亡小体（apoptotic bodies）等新型再生信号分子以及集成基于微球的类器官模型。本综合分析旨在加速下一代微球赋能再生疗法的临床转化。
### 1. 引言
组织与器官的损伤、退变及功能丧失已成为现代医学日益突出的医疗困境。尽管现有的临床干预措施（如器官移植、自体组织移植及人工装置植入）在一定程度上减轻了患者痛苦，但均受限于其根本性缺陷。再生医学旨在通过激活内源性修复通路或递送外源性再生单元来恢复组织功能，已成为最具前景的前沿策略。
组织再生本质上是一个受时空调控的生物学过程。干细胞因其强大的自我更新能力和多向分化潜能，被视为驱动再生过程的核心引擎。其治疗潜力是多维度的：除了直接分化为功能性细胞以替代受损组织外，干细胞还能通过旁分泌（paracrine）途径释放包含生长因子、细胞因子、外泌体（exosomes）乃至线粒体的复杂生物活性物质。这些信号分子形成一个精密的调控网络，重塑局部免疫微环境，抑制过度炎症，促进新生血管形成，并唤醒宿主的内在再生能力。干细胞来源的细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs），尤其是外泌体（exosomes），现已成为组织再生研究的核心前沿。
基于生物材料的微球已成为一种极具吸引力的多功能微载体平台。在结构上，微球的高比表面积为细胞提供了广泛的黏附界面，其内部空隙和颗粒间孔隙网络则为细胞生长和代谢交换提供了必要空间。微球不仅可作为功能性填充物来增强复合支架，还能作为模块化构件，通过“自下而上”的方式自组装成宏观的三维（3D）结构。在生物学上，微球为包封的细胞或细胞组分提供了仿生的3D细胞外基质（extracellular-matrix, ECM）微环境，并创造一个“免疫避难所”，使其免受宿主免疫攻击和严酷的生化环境侵害。作为“活性药物”递送载体，微球可通过合理设计材料组成和结构，实现其负载物的时空精准释放。至关重要的是，载细胞的微球构建体易于注射，能以微创方式高保真地填充入不规则的缺损部位。
基于这些优势，可注射微球的研究领域近年来显著扩展，特别是在精准免疫调节、复杂干细胞衍生物的递送以及基于类器官（organoid）的复合系统的开发方面取得了显著进展。微球平台正从被动递送载体演变为主动调节器；治疗性货物的范围已从完整的干细胞转向线粒体（mitochondria）和脱细胞细胞外基质片段等精细组分。微球技术与类器官（organoids）的深度融合为疾病建模开辟了新维度。
### 2. 生物医学中用于制备微球的材料
可注射微球基系统因其微创给药、高表面积体积比以及时空控制细胞-基质相互作用和生物活性信号呈递的能力，已成为干细胞递送和组织再生的通用平台。基础聚合物的选择是决定微球理化性质（包括降解动力学、机械刚度、表面形貌和生化信号能力）的主要因素。总体上，用于微球制备的聚合材料可分为天然聚合物和合成聚合物。
#### 2.1. 用于微球的天然聚合材料
胶原蛋白（Collagen）是脊椎动物中最丰富的蛋白质，构成了天然ECM的主要支架。由于其优异的生物相容性、低免疫原性、可预测的生物降解性以及无细胞毒性副产物，胶原蛋白已成为生物医学中的典型聚合物。利用乳化法可制备胶原蛋白微球。
明胶（Gelatin）是通过温和水解胶原蛋白获得的天然多肽，保留了精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列。RGD基序的保留使明胶具有与天然胶原蛋白相媲美的优异细胞黏附能力。低成本和良好的降解性进一步加速了明胶在骨、软骨、神经及其他组织工程中的应用。水包油乳化法是最常用的明胶微球制备技术。
壳聚糖（Chitosan）是一种天然来源的多糖，具有无毒、生物相容性、可生物降解和内在抗菌活性等特性。在骨组织工程中，在壳聚糖微球表面制备与组织直接接触的磷灰石涂层，有望增强细胞的黏附、增殖和分化。壳聚糖微球的制备方法包括乳化法、离子凝胶法和冷冻干燥法。
海藻酸盐（Alginate）是一种天然多糖，海藻酸盐微球具有优异的生物相容性、无毒以及能在温和离子交联条件下形成高水合水凝胶的能力，已成为组织工程中递送细胞、生长因子和药物的首选平台。海藻酸盐微球常用乳液法、喷雾干燥法、微流控法或挤出法制备。
透明质酸（Hyaluronic acid, HA）是一种天然的非硫酸化糖胺聚糖，因其优异的亲水性，HA在调节生物体液粘弹性、润滑关节和维持水合作用中发挥核心作用。甲基丙烯酰化透明质酸（MeHA）和丙烯酰化HA（AHA）是细胞封装和再生医学中常用的HA衍生物。
然而，天然聚合物微球常表现出稳定性差、机械强度低及降解迅速等缺点，可通过修饰和交联策略的协同应用得到有效改善。
#### 2.2. 用于微球的合成聚合材料
合成聚合物的出现为细胞微固定化提供了更优越的替代方案。在骨和软骨工程中，具有可调降解性、优异力学性能和可调整结构的可生物降解合成聚合物已成为3D支架和微球载体的首选材料。代表性例子包括聚乳酸（PLA）、聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）、聚乙烯醇（PVA）、聚乙二醇（PEG）和聚己内酯（PCL）。这些合成聚合物可进一步分为水溶性和水不溶性两类。与天然聚合物相比，合成聚合物具有稳定的理化性质、可控质量、无免疫原性、加工灵活和供应可靠等优点。
然而，将天然和合成聚合物融合成复合微球平台带来了一个基本障碍：降解动力学上的显著不匹配常会损害组织整合。实现同步降解是成功复合工程的关键。经过深思熟虑设计的混合体系可利用这种互补性，在相间分配功能角色：天然组分提供初始的生物学指导和临时支持，而合成组分在整个重塑窗口期内维持承重能力。
### 3. 微球的制备
微球的制备是决定其在再生医学中结构属性、理化性质和生物学性能的关键因素。当代制备策略包括相分离、乳化、微流控（Microfluidics）、电喷雾（Electrospray）、喷雾干燥和新兴的增材制造方法。
#### 3.1. 相分离（Phase separation）
相分离或溶剂/非溶剂法是一种基于物理化学现象的微球制备途径。该方法设备简单，适用范围广，但存在微球黏附聚集及制备条件难以精确控制等缺点。
#### 3.2. 微流控（Microfluidics）
微流控技术通过微通道网络精确操控亚微升级流体，以产生高度均匀的液滴。其核心机制依赖于剪切应力和界面张力之间的协同作用。液滴基平台能够在微尺度上对多相流进行时空分辨处理。然而，微流控技术目前在规模化制造、生物相容性和标准化表征方面面临挑战。
#### 3.3. 乳化（Emulsification）
微球的主要制备方法是乳化法。机械剪切强度、粘度、界面张力和表面活性剂浓度共同决定了液滴的尺寸分布。然而，通过乳化方法制备的微球尺寸均匀性通常较差，并且存在稳定性和残留有机溶剂等问题。
#### 3.4. 电喷雾（Electrospray, ES）
电喷雾是一种利用高压静电场将聚合物溶液或熔体分散成微米级液滴的技术。电喷雾常规在空气或真空中进行；然而，一种将原位光聚合与浸没喷流相结合的浸没-电喷雾变体能够实现用于细胞封装的合成水凝胶微球的细胞相容性制备。
#### 3.5. 其他方法
三维打印（3D printing）正成为生产水凝胶微球的主要方法，因其能实现微米级精度和患者特异性几何结构。喷雾干燥（Spray drying）是另一种成熟的微球制备方法，其优点是操作简单、处理速度快且可直接放大。
### 4. 基于微球的干细胞/外泌体递送用于组织再生
基于微球的递送系统已迅速演变为再生医学的核心技术，提供了可注射、模块化和生物响应性的平台。细胞-微球系统的构建方法包括表面吸附（微载体）和内部封装（微胶囊）。微载体的制备可最大限度地减少对细胞的不利影响，从而保持高细胞活力；微胶囊则可实现更高的细胞装载密度，并提供免疫保护。
#### 4.1. 基于微球的干细胞/外泌体递送用于骨再生
骨骼组织通过炎症、修复激活和组织重塑的顺序级联反应对创伤做出响应。微球作为可注射的3D保护性生态位，保护封装细胞和外泌体免于免疫清除。微球介导的基因修饰MSC系统为延长骨诱导信号的生物活性和显著放大骨再生提供了创新转化策略。可注射磷酸钙骨水泥（CPC）已成为骨组织工程中的优选载体之一。微球技术的整合形成了“微球-CPC”复合系统。血管生成（Angiogenesis）先于骨生成且对骨再生至关重要。外泌体携带miRNAs、成骨蛋白和血管生成因子，是连接血管生成和骨生成的关键介质。微球载体利用其可注射性、多孔结构和表面功能化实现外泌体的程序化释放。
#### 4.2. 基于微球的干细胞/外泌体递送用于软骨再生
关节软骨无血管，导致氧气、营养和祖细胞浸润极少，其自然修复能力极为有限。有效软骨修复取决于增强软骨细胞增殖和ECM产生。微球利用可调的孔径和表面化学，创建一个仿生平台，依次提供机械支持、生化信号和免疫调节，与软骨再生需求高度一致。微球增强MSCs的抗炎和免疫调节能力。干细胞来源的外泌体通过旁分泌信号招募驻留祖细胞、诱导软骨形成并抑制炎症。水凝胶微球起到润滑作用并保护外泌体免受酶降解，延长其稳定性和生物活性。
#### 4.3. 基于微球的干细胞/外泌体递送用于神经再生
神经损伤预后不佳。可注射微球提供了一个理想的递送平台，可保护包裹的治疗药物免受酶降解，在损伤部位维持治疗浓度。微球可作为神经再生过程中细胞和生物活性因子共递送的多功能枢纽。神经导管可结合微球支架实现局部和持续的神经因子递送。炎症和免疫调节微球可作为神经血管修复的桥接系统。导电水凝胶微球能提供生理相关的导电性以促进神经突生长。干细胞来源的外泌体是一种现成的再生生物制品，可穿透血脊髓屏障，促进巨噬细胞向M2表型转变，创造利于轴突再生的抗炎微环境。
#### 4.4. 基于微球的干细胞/外泌体递送用于皮肤再生
微球基递送系统因其可注射性、可调降解性和3D微结构而在皮肤再生中脱颖而出。微球系统通过时空控制因子释放动力学和仿生微环境构建，实现对干细胞增殖和旁分泌功能的多层次干预。免疫调节是微球系统促进慢性伤口愈合的核心机制，其关键在于重编程巨噬细胞极化状态。
#### 4.5. 基于微球的干细胞/外泌体递送用于牙髓再生
牙髓是一种高度血管化和神经支配的组织。可注射微球载体因其可通过微创根尖途径递送并提供支持干细胞的3D生态位而比块状支架更具优势。牙髓来源干细胞和来自人脱落乳牙的干细胞是牙髓再生的首选候选细胞。不同细胞来源的外泌体通过互补机制促进牙髓再生。
#### 4.6. 基于微球的干细胞/外泌体递送用于心脏再生
心肌梗死导致不可逆的心肌细胞丢失。干细胞及其外泌体通过增强心肌细胞收缩力来改善收缩功能。基于微球的载体将移植细胞锚定在损伤部位，延长其活力。微环境响应性微球可被利用来靶向并在梗死区域精确释放外泌体。干细胞来源的线粒体是一种新兴的治疗方式。可注射微球作为结合了支架与缓释特性的多功能平台，有效递送细胞、外泌体或线粒体至受损心肌。
#### 4.7. 基于微球的干细胞/外泌体递送用于逆转肺纤维化
肺纤维化（PF）是一种进行性的致命疾病。间充质干细胞微囊化可提供免疫保护并增强其免疫调节能力。引入先天性免疫检查点分子（pCD47）到凝胶包衣可抑制吞噬作用清除，延长包封MSCs在肺部的驻留时间。在PF中，MSCs通过响应微环境信号调节ECM转换。使用微流控技术将MSCs封装在符合性凝胶包衣内，以指导MSC分泌组促进基质重塑。外泌体通过促进肺泡巨噬细胞向抗炎M2表型极化来调节肺部免疫。ROS响应性水凝胶微球与雾化吸入结合具有很高的临床转化潜力。
### 5. 新兴前沿
#### 5.1. 基于微球的凋亡小体递送用于组织再生
凋亡小体（Apoptotic bodies, ABs）是细胞凋亡末期出现的含有细胞质、细胞器和核碎片的小囊泡。干细胞来源的ABs发挥再生、抗炎和免疫调节功能。将ABs装载入明胶微球中，可以保护ABs免于快速系统性清除和过早的膜融合。微球包封的ABs有望成为下一代组织再生策略。
#### 5.2. 基于微球的类器官（Organoids）
在3D体外培养条件下，干细胞可以自组织成类器官（organoids），模拟天然组织的结构、细胞异质性和生理功能。具有可调刚度、孔隙率和表面配体的微球提供了类似ECM的生态位，可增强类器官分化均匀性和提高每个细胞的EV产量。在肌肉骨骼再生中，3D生物打印的载BMSCs微球可自组装成类似骨痂的类器官（organoids），加速成骨。微球、类器官（organoids）及其EVs的协同应用创造了一个闭环的“支架-模型-信号”治疗生态系统。
### 6. 挑战与未来展望
尽管临床前研究显示出巨大潜力，但微球基递送系统向临床转化仍取决于解决几个跨领域的先决条件，包括建立可规模化制造流程、制定保持封装物生物活性的配方策略、建立批次放行的标准化质量控制指标，以及在模拟人类疾病复杂性的临床大动物模型中进行严格的慢性生物安全性评估。
主要挑战包括微球在动态力学环境（如心脏收缩或负重运动）中的稳定性不足。降解产物的长期毒性也值得关注。植入后，包封的干细胞会遇到严酷且通常缺氧的病理微环境。干细胞的代谢适应性是治疗失败的关键因素。从制造角度看，微流控技术的大规模生产可行性受到限制。临床转化还需要在储存稳定性和质量控制方面进行严格的标准化。
### 7. 结论
总之，再生医学正在从简单的组织替代向原位修复和功能重建转变。基于微球的递送系统已成为强大的平台。这些系统通过增强驻留率并在受损的骨、软骨、神经、心肌和肺组织内提供保护性生态位，有效解决了传统细胞疗法的局限性。尽管该领域已取得显著进展，但临床实施仍需克服材料酸性、机械不稳定性和代谢存活等未解决的问题。通过整合合理的生物材料设计、先进的制备技术以及对宿主-微环境相互作用的更深入理解，基于微球的平台有望重新定义无细胞和基于细胞的再生疗法的标准。
