线粒体靶向的基于MXene的纳米酶促进线粒体自噬并抑制mtDNA触发的cGAS/STING炎症在骨关节炎中

《Bioactive Materials》：Mitochondria-targeted MXene-based nanozymes promote mitophagy and inhibit mtDNA-triggered cGAS/STING inflammation in osteoarthritis

　　

骨关节炎（Osteoarthritis, OA）是一种常见且致残的关节疾病，由进行性软骨退化、线粒体功能障碍和慢性炎症驱动。在本研究中，研究人员引入了MS@PMXene-TK，一种创新的线粒体靶向纳米酶，旨在通过针对这些关键病理特征来修复软骨。该纳米酶平台独特地整合了载有软骨诱导肽（SPPEPS）的聚多巴胺（Polydopamine, PDA）修饰的MXene核心（S@PMXene），以及活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）响应性的硫缩酮连接聚乙二醇（PEG-TK）外壳和线粒体靶向肽（MTP-131），从而能够在亚细胞水平进行精确和响应的治疗干预。体外和体内分析表明，MS@PMXene-TK有效清除软骨细胞内的线粒体ROS，作为“巡航导弹”，导致线粒体膜电位恢复和线粒体自噬促进。这一级联反应减轻了mtDNA泄漏和随后环磷酸鸟苷-腺苷合成酶-干扰素基因刺激因子（cGAS/STING）通路的激活，cGAS/STING通路是OA中的关键炎症驱动因素。同时，SPPEPS的持续释放增强了软骨形成标志物表达和细胞外基质合成，同时减轻了巨噬细胞介导的炎症反应，进一步调节炎症微环境。在前交叉韧带横断（Anterior Cruciate Ligament Transection, ACLT）诱导的OA小鼠模型中，关节内给药MS@PMXene-TK显著改善了软骨保护和软骨下骨完整性。这些发现确立了这种靶向、多模态纳米酶策略在破坏OA中氧化应激和炎症相互交织的病理学方面的潜力，为OA治疗提供了一条有希望的途径。

研究背景与意义：骨关节炎（Osteoarthritis, OA）是一种以软骨退化、线粒体功能障碍和慢性炎症为特征的退行性关节疾病。现有治疗手段多为缓解症状，缺乏有效逆转疾病进展的方法。线粒体功能障碍导致活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）过度生成，进而触发线粒体DNA（mtDNA）泄漏，激活胞质cGAS/STING炎症通路，加剧软骨细胞损伤和炎症微环境。同时，线粒体自噬（mitophagy）受损进一步破坏了线粒体质量控制。因此，亟需开发能够靶向线粒体、清除ROS、促进线粒体自噬并抑制cGAS/STING炎症的多功能纳米平台。本研究报道了一种线粒体靶向的基于MXene的纳米酶MS@PMXene-TK，通过整合软骨诱导肽SPPEPS、ROS响应的硫缩酮键（TK）和线粒体靶向肽MTP-131，在皮下和体内水平实现了对OA的多靶点协同治疗，为OA治疗提供了新策略。论文发表在《Bioactive Materials》。

关键技术方法概述（不超过250字）：研究人员采用以下关键技术方法：①通过选择性刻蚀Ti₃AlC₂制备MXene（Ti₃C₂T_x）纳米片；②通过多巴胺自聚合形成聚多巴胺（PDA）涂层，并负载软骨诱导肽SPPEPS，获得S@PMXene核心；③进一步在表面修饰ROS响应的硫缩酮连接聚乙二醇（PEG-TK）和线粒体靶向肽MTP-131，构建MS@PMXene-TK纳米酶；④利用透射电镜（TEM）、动态光散射（DLS）、Zeta电位、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、X射线衍射（XRD）和X射线光电子能谱（XPS）进行材料表征；⑤使用原代小鼠软骨细胞和RAW264.7巨噬细胞进行体外实验；⑥采用前交叉韧带横断（ACLT）诱导的C57BL/6小鼠OA模型进行体内疗效评估（上海第九人民医院伦理委员会批准，SH9H-2025-A20-1）。这些方法涵盖了纳米材料的合成、表征、细胞功能验证及动物模型评价。

研究结果：
2.1 制备与表征：通过TEM、DLS、Zeta电位、FTIR、XRD和XPS证实MS@PMXene-TK成功合成，PDA涂层保护MXene并增加药物负载位点，PEG-TK和MTP-131成功修饰。MS@PMXene-TK具有显著的ROS清除能力，对H₂O₂、·O₂^?和·OH的清除率分别达约86%、75%和显著水平。
2.2 生物相容性、细胞摄取、线粒体靶向与ROS清除：Live/Dead染色和CCK-8实验表明，浓度≤50 μg/mL时软骨细胞存活率>95%。Cy5.5标记的纳米酶在7 h内被软骨细胞时间依赖性内化。MitoTracker共定位分析显示，MTP-131修饰显著增强纳米酶与线粒体的共定位（Pearson相关系数更高）。DCFH-DA染色和流式细胞术证实，MS@PMXene-TK在H₂O₂和IL-1β刺激下最有效地降低细胞内ROS水平。
2.3 炎症条件下的软骨诱导效应：qPCR、免疫荧光和番红O染色显示，MS@PMXene-TK显著上调Col2a1、Sox9和Acan等软骨合成基因，同时抑制Mmp3、Mmp13和Adamts5等分解基因。Western blot进一步确认胶原II、SOX9和聚集蛋白聚糖（Aggrecan）蛋白水平升高，MMP13、MMP3和ADAMTS5水平降低。
2.4 线粒体调控效应：TMRM染色表明MS@PMXene-TK恢复线粒体膜电位（ΔΨm），MitoSOX染色显示其降低线粒体ROS（mtROS）水平。LysoTracker共定位增加表明促进线粒体自噬体形成。Western blot显示BNIP3、PINK1、Parkin表达恢复，p62降低。qPCR显示抗氧化酶SOD1、GPx1、CAT和NRF2表达升高。SA-β-Gal染色和qPCR证实MS@PMXene-TK减轻IL-1β诱导的软骨细胞衰老。
2.5 MS@PMXene-TK诱导的线粒体自噬改善软骨细胞功能：使用线粒体自噬抑制剂Mdivi-1后，MS@PMXene-TK的促软骨生成效应（COL2A1、SOX9、GAG）被逆转，MMP13升高。转录组测序（RNA-seq）显示MS@PMXene-TK逆转了IL-1β下调的线粒体自噬相关基因（Pink1、Prkn、Fundc1、Optn）。KEGG和GO富集分析揭示与mtDNA感知通路（cytosolic DNA-sensing）和cGAS/STING通路相关。进一步发现MS@PMXene-TK抑制cGAS/STING及其下游IRF3靶基因表达，GSEA显示胞质DNA感知、RIG-I样受体和JAK-STAT信号减弱。
2.6 MS@PMXene-TK通过抑制mtDNA泄漏依赖的cGAS/STING炎症：Calcein AM/Co²⁺淬灭实验显示MS@PMXene-TK改善IL-1β引起的线粒体通透性转换孔（mPTP）开放。qPCR和dsDNA/Tomm20免疫荧光染色表明Mdivi-1逆转了MS@PMXene-TK减少的胞质mtDNA泄漏。Western blot证实Mdivi-1处理激活cGAS/STING通路（cGAS、p-STING、p-TBK1升高），而siRNA敲低STING后部分恢复了Mdivi-1抑制的软骨生成标志物（COL2A1、SOX9、MMP13）。
2.7 对巨噬细胞炎症表型的影响：qPCR显示MS@PMXene-TK降低IL-1β诱导的促炎因子（IL-1β、IL-6）表达，升高抗炎因子（IL-10、TGF-β）。免疫荧光和Western blot表明M1标志物（iNOS、CCR7）下调，M2标志物（Arg1、CD206）上调，诱导巨噬细胞向抗炎表型极化。
2.8 体内OA软骨再生评价：在ACLT诱导的OA小鼠模型中，ICG标记示踪显示MS@PMXene-TK在关节腔内滞留可达72 h。Micro-CT显示MS@PMXene-TK显著增加骨体积分数（BV/TV）和骨小梁数目（Tb.N），降低骨小梁分离度（Tb.Sp）。组织学（H&E、SO-FG染色）和OARSI评分证实软骨结构改善、滑膜炎减轻。免疫组化显示COL2A1表达增加，MMP3、pTBK1降低。免疫荧光显示iNOS下调、Arg1上调。CatWalk步态分析显示后足印面积和步长恢复接近正常。重复剂量关节内给药安全评估（血常规、肝肾功能）未发现明显毒性。

总结讨论与结论：研究表明，MS@PMXene-TK通过清除mtROS、恢复线粒体膜电位、促进线粒体自噬，有效减少mtDNA泄漏，从而抑制cGAS/STING炎症通路，同时SPPEPS缓释促进软骨基质合成，并调节巨噬细胞向M2极化，改善炎症微环境。体内实验证实其能显著缓解OA进展，保护软骨和软骨下骨。结论指出，这种“线粒体ROS巡航导弹”策略为OA及其他ROS相关炎症性疾病提供了有前景的治疗方案。