《Bioactive Materials》：Organoid-loaded core-shell cryomicroneedles induce biomimetic follicular units and hair regeneration
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组织工程化毛囊再生为增加毛囊数量提供了一种极具前景的方法，但其仍面临诸多挑战，例如毛发难以穿透皮肤表面，以及易出现成簇且无序生长的问题。因此，实现单根或双根毛囊单位的仿生再生至关重要。微针阵列(MNs)能够模拟天然毛发密度，实现对毛发生长方向和密度的可控调节。
组织工程化毛囊再生为增加毛囊数量提供了一种极具前景的方法，但其仍面临诸多挑战，例如毛发难以穿透皮肤表面，以及易出现成簇且无序生长的问题。因此，实现单根或双根毛囊单位的仿生再生至关重要。微针阵列(MNs)能够模拟天然毛发密度，实现对毛发生长方向和密度的可控调节。然而，目前大多数用于毛发再生的MNs均设计为药物递送用途，只能调节现有毛囊的毛发生长周期，无法在秃发区域实现新生毛囊的生成。专为组织工程化毛囊递送设计的MNs十分罕见，且在维持细胞活力及实现表皮突破方面面临巨大挑战。基于此，研究人员开发了一种基于核壳MN技术和毛囊类器官(HFOs)培养的新策略，用于毛囊单位再生。在本研究中，研究人员将HFOs装载于具有均匀壁厚和多通道的可降解核壳冷冻微针(CryoMNs)中。将其应用于裸鼠模型后，该核壳CryoMNs成功支持了仿生毛囊单位的生长，模拟了天然毛发再生过程。这种可控降解的核壳CryoMNs为HFOs提供了营养通道，并为毛发生长开辟了皮肤通道，从而控制了毛发的生长方向和间距，使得脱发患者能够实现有序的毛囊单位再生。本研究为类器官的皮下递送和组织工程化毛囊的系统再生提供了新的思路和策略。
研究背景与挑战
毛发脱落已成为一项重大的全球性健康问题，影响着全球约50%的成年人。目前的常规干预手段主要包括药物治疗和外科植发手术，但这些方法既不能增加毛囊的总数量，也不适用于大面积脱发患者。相比之下，组织工程化毛囊再生具有扩大毛囊总量的独特潜力。然而，现有的体外培养毛囊祖细胞(HFPCs)递送方法，如皮下注射或基于腔室的植入技术，常导致真皮层内毛发聚集而无法穿透表皮，且易引发额外的手术创伤和疤痕。此外，这些方法常导致局部毛发堆积且生长方向不可控，无法满足自然外观毛发修复的美学要求。尽管微针阵列(MNs)具备无痛透皮和可调间距的优势，但现有的细胞负载MNs往往缺乏形成的毛囊类器官(HFOs)，且快速降解的水凝胶无法防止皮肤回缩闭合，阻碍了毛发穿透表皮。因此，开发慢降解的MN外壳以辅助细胞突破表皮屏障显得尤为迫切。
关键技术方法
为实现上述目标，研究人员采用了多项关键技术。首先，从成年C57BL/6小鼠触须垫组织中提取并分离毛囊单位，获取真皮乳头细胞(DPCs)及其聚集体——真皮乳头球体(DPSs)。其次，采用双层三明治法制备了具有均匀壁厚、多通道结构的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA) MN外壳，其孔径精确控制在50至70微米。第三，优化了三维HFOs的培养条件，确定了最佳细胞接种量、基质胶浓度，并引入R-脊椎蛋白1(RSPO1)作为Wnt/β-连环蛋白信号通路激动剂以促进毛囊出芽。最后，利用冷冻微针(CryoMNs)技术，将培养成熟的HFOs在含有二甲基亚砜(DMSO)和基质胶的冻存液中进行梯度冷冻，制备出HFO-CryoMNs，并将其与PLGA MN外壳在低温下精准嵌套组装，形成最终的PLGA@HFO CryoMNs系统。该系统随后被应用于裸鼠体内，以评估其毛发再生能力。
研究结果
2.1 负载HFOs的均匀壁厚多通道核壳CryoMNs设计
研究人员测量了小鼠DPSs的直径范围，以此为依据设计了内径为500微米的MN结构。为解决传统核壳MNs包壳厚度不均的问题，开发了互补的MN模具和压帽。每个MN设计中集成了八个通道，孔径设定在50至70微米之间，既保证了营养物质的选择性渗透以维持细胞存活，又防止了细胞流失。
2.2 模拟天然毛发生长的MNs设计与制备
研究人员设计了10乘10的MN阵列，间距为1150微米，对应植入密度为69毛囊单位每平方厘米，更贴近临床生理范围。结合CryoMNs的设计方案，设置了1300微米的平行MN阵列深度，以匹配毛发通常起源于真皮深层且平行排列的特征。通过生物可降解材料PLGA在模具内浇铸并经压帽加压，成功制备出具有多通道结构的MN外壳。
2.3 负载HFOs的多通道PLGA MNs表征
制备出的PLGA MN呈现出均匀的薄壁不透明白色结构。扫描电子显微镜(SEM)图像显示其周围对称分布着八个相互连接的通道。力学测试表明，单个PLGA MN的断裂力为1.3牛，表现出显著的刚性。当PLGA MN负载CryoMNs后，其穿刺深度达到766正负8微米，优于未修饰的外壳。降解实验显示，在含脂肪酶的培养基中孵育14天后，MNs重量降至初始重量的24%，同时乳酸浓度稳步上升至4.44毫摩尔每升。细胞相容性评价表明，与PLGA MN共培养72小时后，小鼠和人类DPCs的活力均保持在90%以上。
2.4 三维HFOs体外培养条件的优化
研究人员优化了HFPCs的培养条件。结果表明，当细胞数量为800个每孔时，可确保稳定的毛囊胚(HFGs)形成。添加基质胶能显著增大HFOs直径并促进毛发生长，其中2%的基质胶浓度最为适宜。在MN模具内进行三维培养时，接种10000个细胞可获得最高的毛囊出芽率，而添加Wnt激动剂RSPO1可将出芽率进一步提升至90.00正负1.00%。
2.5 MN模具内HFOs的三维培养及CryoMN制备
在MN模具中培养的HFOs在24小时内完成聚集，细胞活力高达84.52正负2.25%。经过梯度冷冻程序，成功制备了HFO-CryoMNs。形态学观察证实，解冻后的HFOs内部真皮细胞(DCs)定位于外周，表皮细胞(ECs)局限于内部，呈现出典型的HFGs结构。解冻后的细胞活力保持在65%以上，证实了冷冻保存过程的有效性。
2.6 PLGA@HFO CryoMNs的制备及内部HFOs形态与活力评价
研究人员将HFO-CryoMNs与PLGA MNs精准对齐嵌套，构建了核壳结构的PLGA@HFO CryoMNs。免疫荧光染色显示，DCs和ECs在HFOs内的空间分布符合发育特征。解冻培养3天和7天的HFO-CryoMNs细胞活力无显著差异，证明了该平台在维持细胞活性方面的稳定性。
2.7 PLGA@HFO CryoMNs诱导的仿生毛囊单位再生
体内实验显示，PLGA@HFO CryoMNs处理组的裸鼠背部皮肤在14天后观察到了黑色毛发生长，而对照组均未长出毛发。再生的毛囊单位主要为单根毛发，少数为双根，间距约为2毫米，实测密度为55正负10毛囊单位每平方厘米，接近理论植入密度。苏木精-伊红(H&E)染色证实存在毛囊组织，且再生毛干直径与天然毛发相当。gp100荧光染色强度显著高于天然毛发，证明其为新生成的黑色素毛发。长期观察发现，再生毛囊经历了完整的生长期、退行期和休止期循环，并在第7周重新进入生长期。
2.8 PLGA@HFO CryoMNs介导的再生毛发特异性标记物免疫荧光染色表征
免疫荧光染色结果显示，再生毛囊中富含Sox2、Ki67、β-连环蛋白、Krt14、CD34和α-SMA等关键标志物。这些标志物的特异性表达模式证实了再生毛囊具备了活跃的细胞增殖、毛囊诱导、上皮分化、干细胞储备以及立毛肌附着等典型结构与功能特征。
讨论与结论
局限性与展望
研究人员指出，目前7周的随访期和小样本量不足以确认持续的多周期再生，未来需要进行更大队列的扩展研究。此外，虽然PLGA MNs与人类DPCs表现出良好的相容性，但尚未证明人类HFPCs衍生的类器官能在CryoMN平台中形成。鉴于新生儿小鼠与成人人类HFPCs之间的生物学差异，验证人类类器官的相容性仍是未来临床研究的前提。
结论
研究人员利用嵌套式MN模具设计和双层三明治制备方法，开发出了具有机械稳定性、生物可降解性和均匀壁厚的PLGA MNs。随后，研究人员在MN模具内成功培养了三维HFOs，并观察到其出芽及新生毛发形成。接着，研究人员将这些HFOs装载到PLGA MNs中，制造出可生物降解的核壳微针，利用MN外壳通道确保了HFOs在体内的长期存活并诱导了毛发再生。研究结果表明，这些核壳CryoMNs刺激了裸鼠黑色毛发的生长，通过毛囊单位形成模拟了天然毛发生长模式。设计的MN外壳不仅促进了HFOs的装载，还为毛发穿透皮肤提供了导管，从而初步实现了对毛发生长方向和密度的控制。该方法克服了传统组织工程化毛发再生的主要局限性，包括毛发萌出受阻以及成簇无序生长等问题。
