单细胞与纵向转录组学引导的靶向FZD1的精准纳米疗法对抗骨肉瘤癌症干细胞

《Bioactive Materials》：Single-cell and longitudinal transcriptomics-guided engineering of FZD1-targeting precision nanotherapy against osteosarcoma cancer stem cells

　　

骨肉瘤是儿童和青少年中最常见的原发性恶性骨肿瘤。骨肉瘤癌症干细胞（OCSCs）通过其自我更新能力和治疗抵抗性关键驱动肿瘤发生和进展。因此，理解维持OCSC干性的机制并识别关键治疗靶点对于有效干预至关重要。在此，研究人员利用单细胞和纵向RNA测序（RNA-sequencing）系统地分析了OCSC转录组特征，识别了与OCSC干性相关的转录因子7类似物1（TCF7L1）相关转录活性，以及卷曲类受体1（FZD1）相关的Wnt/β-catenin信号通路作为推测的上游通路。FZD1表达与骨肉瘤临床恶性进展显著相关。利用这些转录特征，研究人员筛选并验证了高三尖杉酯碱（homoharringtonine）作为针对骨肉瘤和OCSCs的有效治疗药物。为了增强疗效同时降低全身毒性，研究人员设计了一种FZD1靶向、pH/谷胱甘肽（glutathione）双响应纳米平台，通过UM206肽与FZD1的高亲和力结合实现对OCSC衍生肿瘤的精确药物递送，同时在酸性、富含谷胱甘肽的微环境中实现肿瘤微环境触发的药物释放。这种整合方法表征了OCSC相关的转录调控，并支持进一步开发针对骨肉瘤的OCSC靶向精准纳米疗法。

骨肉瘤是儿童和青少年中最常见的原发性恶性骨肿瘤，尽管化疗可提高局部患者5年生存率至约60%，但转移或复发者生存率仍低于30%。肿瘤内异质性是治疗失败的主要原因，而骨肉瘤癌症干细胞（OCSCs）作为异质性的关键驱动力，通过自我更新、不对称分裂和抵抗凋亡等特性促进肿瘤发生、转移和复发。然而，OCSC维持干性的分子调控网络和有效药物靶点尚不明确。因此，需要系统表征OCSC以开发靶向治疗策略。研究人员整合了17例人类骨肉瘤样本的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据（145198个细胞）和时间依赖性RNA测序（time-dependent RNA-seq），首次揭示转录因子7类似物1（TCF7L1）相关转录活性与OCSC干性的关联，并确定卷曲类受体1（FZD1）关联的Wnt/β-catenin信号作为上游调控通路。FZD1表达与骨肉瘤临床恶性进展和不良预后显著相关。基于这些转录特征，通过Connectivity Map（CMap）筛选并验证高三尖杉酯碱（homoharringtonine, HHT）为高效治疗药物。为进一步增强疗效并降低全身毒性，研究人员设计了一种FZD1靶向、pH/谷胱甘肽（GSH）双响应纳米平台（HAU），利用UM206肽与FZD1的高亲和力结合实现精准递送，并在酸性、富含GSH的肿瘤微环境中触发HHT释放。该集成策略表征了OCSC相关转录调控，支持开发靶向OCSC的精准纳米疗法用于骨肉瘤治疗。论文发表在《Bioactive Materials》。

**主要关键技术方法**：研究人员使用公开的人类骨肉瘤样本scRNA-seq数据集（GSE152048, GSE162454）和时间依赖性RNA-seq分析OCSC转录组。通过pySCENIC分析转录因子活性，加权基因共表达网络分析（WGCNA）和差异基因筛选鉴定FZD1。利用CMap筛选小分子化合物。通过分子对接和分子动力学模拟验证UM206与FZD1的结合。合成pH/GSH双响应材料AcsCD制备纳米颗粒。采用OCSC皮下异种移植模型评估体内疗效。

**研究结果**：
**2.1 增加的TCF7L1转录活性与骨肉瘤干性特征相关**：scRNA-seq分析显示，subcell_12亚簇（占骨肉瘤细胞2.02%）具有最高分化潜能，特异性高表达SOX2和PROM1（CD133基因），代表OCSCs。TCF7L1(+)活性与SOX2(+)活性高度相关，方差分解表明TCF7L1(+)对OCSC干性贡献80.9%。时间依赖性RNA-seq证实SOX2(+)和TCF7L1(+)活性随OCSC培养时间延长而增加，且Wnt/β-catenin信号通路显著激活。
**2.2 FZD1作为骨肉瘤干性和不良预后的关键标志物**：WGCNA、差异基因筛选和交集分析识别FZD1等5个基因。FZD1在OCSC中mRNA和蛋白水平显著升高，且与临床肿瘤淋巴结转移（TNM）分期正相关，高表达患者总生存和无转移生存显著降低。FZD1敲低减少SOX2和CD133蛋白，抑制OCSC球形成，并降低核β-catenin积累和增加β-catenin降解相关磷酸化。UM206肽（FZD1拮抗剂）诱导FZD1内化，抑制Wnt下游基因AXIN2和干性标志物SOX2、PROM1，减少球形成。
**2.3 转录谱识别BRD-K76674262（HHT）为高效治疗药物**：CMap反向筛选将HHT列为逆转OCSC转录特征的最优化合物。HHT对骨肉瘤细胞和OCSC具有低半数抑制浓度（IC₅₀），显著抑制OCSC球形成，诱导>60%细胞凋亡，降低核SOX2蛋白水平。体内实验中，0.5 mg/kg HHT有效抑制肿瘤生长，但2.5 mg/kg导致体重下降、造血和肝肾毒性。
**2.4 FZD1靶向pH/GSH双响应纳米颗粒的制备与表征**：合成AcsCD（乙酰化二硫键桥连β-环糊精二聚体）作为双响应材料，制备四种HHT纳米颗粒：非靶向非响应（HP）、靶向非响应（HPU）、非靶向响应（HA）、靶向响应（HAU）。HAU在pH 5.5和10 mM GSH条件下12小时释放约90%药物，而HPU无响应。所有纳米颗粒呈球形，粒径约177-221 nm，ζ电位负值，胶体稳定性良好。
**2.5 增强靶向和摄取**：UM206功能化纳米颗粒（CPU和CAU）在骨肉瘤细胞和OCSC球中显著提高细胞内化效率，FZD1敲低后摄取降低。体内荧光成像显示，CPU和CAU在OCSC异种移植模型中优先肿瘤积累，72小时离体分析证实靶向性。共聚焦显微镜显示靶向纳米颗粒在肿瘤细胞中呈胞质分布。
**2.6 体外抗肿瘤效应和转录组机制**：HAU在0.001-1 μg/mL HHT浓度下显示出最强细胞毒性，IC₅₀为0.014 μg/mL（比游离HHT低7.6倍）。HAU显著抑制OCSC球体积，TUNEL染色证实广泛凋亡。RNA-seq分析表明，HAU更全面抑制Wnt/β-catenin信号通路和干性相关转录程序，降低mRNA表达干性指数（mRNAsi），下调FZD1、TCF7L1、CTNNB1、AXIN2，并上调BAX/BCL2比值。
**2.7 体内抗肿瘤疗效和机制验证**：在HOS-OCSC和143B-OCSC皮下模型中，HAU显着抑制肿瘤生长，肿瘤体积在治疗12天后开始消退，最终肿瘤重量最小。HAU组生存期显著延长（80%小鼠保持缓慢生长）。组织学分析显示HAU诱导广泛坏死、抑制Ki-67和PCNA增殖标志物、增加TUNEL阳性凋亡细胞。多重免疫荧光和Western blot证实HAU降低FZD1、TCF7L1、β-catenin、SOX2和CD133蛋白水平，且下调SOX2和PROM1 mRNA。安全性评估显示HAU对血液学指标和主要器官无明显毒性。

**讨论部分**：研究人员指出，FZD1驱动的Wnt/β-catenin信号与TCF7L1转录活性是OCSC干性维持的关键机制，与临床恶性进展相关。HHT通过核糖体抑制发挥抗干性作用，但游离HHT有全身毒性。HAU纳米疗法通过FZD1靶向和pH/GSH双响应释放，在提高疗效同时降低副作用。局限性包括：免疫缺陷小鼠无法评估适应性免疫；缺乏标准MAP化疗对照；需进一步通过极限稀释移植和原位模型验证OCSC致瘤能力；FZD1对TCF7L1的调控机制需ChIP等实验证实。
**结论**：总之，本研究表明，FZD1关联的Wnt/β-catenin信号和TCF7L1介导的转录活性有助于OCSC干性维持，这是通过OCSC的转录图谱揭示的。基于这些发现，研究人员开发了HAU，一种FZD1靶向、pH/GSH双响应纳米治疗药物，用于向OCSC选择性递送HHT。该纳米疗法利用FZD1靶向肽UM206实现OCSC特异性定位，并结合肿瘤微环境响应性纳米载体实现药物时空控制释放。这种协同设计使HHT在OCSC中选择性积累和触发释放。生物分布谱的定量分析确认了优先肿瘤定位和减少脱靶器官暴露。因此，相对于游离HHT，该纳米治疗策略实现了有效的OCSC根除、抑制原发肿瘤生长、延迟皮下异种移植模型中肿瘤负荷定义的终点，并显著降低全身毒性。总之，研究人员的发现建立了一种有前景的OCSC靶向纳米治疗方法，能够克服干性相关的治疗抵抗，并扩展实体瘤定向纳米疗法的范式。