基于异裂钌(II)配合物的声波催化剂可触发气道死亡蛋白D的棕榈酰化，从而增强抗缺氧的非传统焦亡免疫疗法

《Biomaterials》：Heteroleptic ruthenium(II) complexes-based sonocatalysts trigger gasdermin D palmitoylation to augment hypoxia-resistant non-canonical pyroptotic immunotherapy

　　韩旭|方面伟|侯梦杰|钟立蝉|冯玉峰|沈星灿 中国教育部药用资源化学与分子工程重点实验室，广西药用资源化学与分子工程重点实验室，广西特色药用资源化学大学工程研究中心，广西师范大学化学与药学学院，中国广西桂林541004

摘要
声动力疗法有望诱导癌细胞发生焦亡并激活免疫反应。然而，其效果受到肿瘤缺氧微环境的限制。此外，尽管有研究指出这些声敏剂可通过触发气道蛋白D棕榈酰化相关的非典型焦亡途径来提升肿瘤的免疫原性，但相关研究仍较为缺乏。本文设计了一系列杂环钌(II)多吡啶单层g-C3N4量子点衍生物。其中，含有菲和二吡啶[3,2-a:2',3'-c]菲嗪配体的Ru1SLCN作为声催化剂，可通过超声驱动的电子-空穴对分离及能带倾斜作用，催化H2O或H2O2分解，从而在线粒体中大量产生活性氧物种。Ru1SLCN不仅能破坏线粒体的氧化代谢，还能上调ZDHHC5和ZDHHC9蛋白的表达，促进GSDMD和GSDMD-NT的棕榈酰化。同时，该物质还会抑制线粒体自噬，打破焦亡检查点，进而增强非典型焦亡的效应。这会导致细胞膜出现大量孔洞，使细胞内容物及损伤相关分子模式释放出来，进一步强化长期免疫反应。此外，它还能有效改变免疫抑制微环境，从而显著抑制肿瘤的生长和转移。本研究首次提出了一种通过激活GSDMD棕榈酰化介导的非典型焦亡来实现声免疫疗法的新方法，为金属免疫疗法中调节免疫活性提供了新的靶点。

引言
癌症免疫疗法被视为治疗肿瘤最具前景的方法之一，已被证实具有显著的治疗效果，能有效防止肿瘤的转移和复发[1][2]。然而，肿瘤的免疫抑制微环境包括缺氧、间质液压力升高以及调节性T细胞的浸润[3][4]。在这些障碍中，作为实体瘤特征性的肿瘤缺氧，通过诱导免疫细胞功能异常（如细胞毒性T细胞耗竭）、上调免疫抑制分子（如程序性死亡配体1，PD-L1）以及招募多种免疫抑制细胞（如调节性T细胞、髓源性抑制细胞和M2表型的肿瘤相关巨噬细胞）[5][6][7]，在抑制抗肿瘤免疫反应中起着关键作用。因此，亟需开发能够克服缺氧诱导的免疫抑制作用的新型免疫疗法，以提高肿瘤的免疫原性。

焦亡是一种具有炎症反应的典型免疫原性细胞死亡方式，主要由气道蛋白家族介导，其中气道蛋白D是最为知名的执行分子。一旦被激活，GSDMD会被切割成N端结构域GSDMD-N，该结构域会在细胞膜上聚集形成孔洞，导致细胞内容物及细胞内促炎因子释放[8]。此外，焦亡还能逆转免疫抑制细胞的抑制作用[9][10]。根据激活机制的不同，焦亡可分为经典型（依赖半胱天冬酶-1）和非经典型（依赖半胱天冬酶-4/5/11），后者通常依赖于细胞内活性氧物种的生成[11]。尽管非经典型焦亡由于其独特的激活机制而不易被肿瘤细胞利用，但自噬可通过自噬-溶酶体途径降解GSDMD-N来抑制焦亡，其中p62/SQSTM1在识别并输送GSDMD-N至溶酶体降解过程中起关键作用[12]。与此同时，缺氧的肿瘤细胞往往会上调自噬能力以逃避焦亡性细胞死亡[13][14]，还会诱导ROS清除及代谢重编程，从而抑制GSDMD的切割和聚集[15][16]。幸运的是，吴等人的研究首次发现，GSDMD的S-棕榈酰化及其激活需要外源性的ROS激活剂，这类激活剂无需炎性小体即可诱导焦亡[17]。具体而言，GSDMD的棕榈酰化可增强其与细胞膜的亲和力，促进功能性孔洞的形成，放大焦亡反应，从而弥补传统焦亡途径的不足[18]。重要的是，GSDMD的棕榈酰化能够在缺氧条件下维持GSDMD-N在细胞膜上的定位，从而克服缺氧引起的焦亡抑制[19]。因此，迫切需要在实体瘤中精准靶向GSDMD的棕榈酰化，打破自噬检查点对焦亡的抑制，以提高肿瘤的免疫原性并克服免疫抑制微环境的阻碍。

声动力疗法作为一种极具前景的肿瘤治疗策略，其优势在于超声波能够深入组织（超过10厘米），并精确地触发声敏剂产生活性氧物种[20]。在各类声敏剂中，金属复合物因其独特的氧化还原性质、可调控的电子结构以及调节细胞内信号通路的潜力，越来越被用于提升声动力疗法对肿瘤的治疗效果[21][22]。尽管有一些研究表明，金属复合物可诱导经典型焦亡，从而激活肿瘤的免疫原性[23][24]，但由于基于金属复合物的声敏剂产生的单线态氧效率较低，加上肿瘤缺氧微环境的影响，其在声动力免疫疗法中的效果并不理想[25]。尤其是缺氧的肿瘤细胞能够适应持续的缺氧环境，获得抗细胞死亡能力，规避药物或声动力引发的焦亡性裂解，并在低氧条件下持续增殖，从而对声动力免疫疗法产生耐药性。

最近的研究表明，基于金属复合物的纳米压电生物材料或纳米异质结有望突破这一瓶颈[20][26]。然而，在超声波照射下，电子和空穴的分离难度较大，且两者结合的速度极快，仅为数十到数百纳秒，这大大限制了活性氧的生成量[20][27][28]，进而降低了依靠经典型焦亡途径实现的实体瘤声动力免疫疗法的效果。石墨碳氮化物具有内在的压电性，这一特性使其在肿瘤治疗或废水中有机污染物去除方面具有独特优势[29]。值得注意的是，通过增加其比表面积或螯合金属基团，可进一步提升g-C3N4的压电催化性能[29][30]。此外，我们此前还发现，与g-C3N4纳米片相比，与g-C3N4纳米片配位的钌(II)复合物通过光催化作用可实现极高的电子-空穴分离速率（微秒级），这非常有利于在缺氧肿瘤中产生活性氧[31]。而单层g-C3N4量子点由于具有较大的比表面积和丰富的活性位点，其声动力效应优于g-C3N4纳米片[32]。鉴于ZDHHC5/ZDHHC9-GSDMD棕榈酰化途径的抑制以及非典型焦亡的阻断是肿瘤细胞产生缺氧耐药性的原因，目前尚无报道指出利用与单层g-C3N4量子点配位的钌(II)复合物，通过超声诱导的GSDMD棕榈酰化来增强对抗缺氧耐药性的非典型焦亡免疫疗法，这一方法有望恢复该修饰途径，激活非典型焦亡，从而逆转缺氧耐药性。

为此，我们设计了三种采用不同多吡啶配体与钌(II)配位的单层g-C3N4量子点。其中，仅含有1,10-菲咯啉和二吡啶[3,2-a:2',3'-c]菲嗪配体的Ru1SLCN表现出出色的声毒性，这是因为它在缺氧条件下可通过声催化H2O或H2O2的分解，产生大量的线粒体活性氧物种（如?O2-和?OH），这种低氧依赖性的活性氧生成有助于通过超声诱导的GSDMD棕榈酰化来增强对抗缺氧耐药性的非典型焦亡免疫疗法。与其他两种声敏剂相比，Ru1SLCN由于其能带倾斜和较窄的能隙，表现出更高的电子-空穴分离效率。在超声波作用下，Ru1SLCN产生的大量线粒体活性氧不仅会引发经典的声动力疗法介导的细胞凋亡，还会上调线粒体中ZDHHC5和ZDHHC9蛋白的表达，进而促进GSDMD和GSDMD-NT的棕榈酰化，最终引发焦亡。此外，Ru1SLCN还能通过上调LC3-II和p62/SQSTM1蛋白来抑制肿瘤细胞特有的自噬，这一作用有望打破焦亡检查点，进一步增强GSDMD棕榈酰化介导的焦亡性癌症疗法，从而增加细胞膜孔洞的形成。这将导致大量细胞内容物及损伤相关分子模式释放出来，有效激发长期的抗肿瘤免疫反应，同时减少免疫抑制性的M2极化巨噬细胞和调节性T细胞的数量，最终抑制肿瘤生长，防止C57BL/6J小鼠携带Lewis肺癌肿瘤时的肿瘤复发和转移（见图1）。本研究首次提出了一种针对缺氧肿瘤中GSDMD棕榈酰化介导的非典型焦亡的声动力免疫疗法策略，为金属免疫疗法的发展提供了新的思路。

段落摘录
RuSLCN声催化剂的合成与表征
单层g-C3N4量子点的制备方法是参考先前的文献报道[32]。金属复合物前体[Ru(phen)(dppz)Cl2]、[Ru(bpy)(dppz)Cl2]（bpy为2,2'-联吡啶）以及[Ru(phen)(ppl)Cl2]（ppl为吡razino[2,3-f][1,10]菲咯啉）的合成方法与先前报道一致（见图S1）[31]。这些前体的身份通过1H-NMR光谱和质谱分析得以确认（见图S1–S3）。前体与单层g-C3N4量子点之间的配位反应是通过常规的热处理实现的。

结论
总之，我们基于单层g-C3N4量子点设计了三种钌(II)复合物，其中仅有含有菲和二吡啶[3,2-a:2',3'-c]菲嗪配体的Ru1SLCN表现出出色的声催化活性，能够通过催化H2O或H2O2的分解产生活性氧物种（如?O2-和?OH），因此也具有最高的声细胞毒性。密度泛函理论计算揭示了其催化机制，表明特定的配位环境使得能带结构变窄，从而有助于电荷的增强和定向传递。

作者贡献说明
侯梦杰：实验验证、方法学研究。韩旭：论文撰写与修订、初稿撰写、实验验证、软件应用、方法学研究、实验分析、数据整理。冯玉峰：方法学研究、数据整理。钟立蝉：实验验证、实验研究。沈星灿：论文撰写与修订、可视化处理、项目监督、资源协调、项目管理、资金申请、概念设计。方面伟：论文撰写与修订、初稿撰写、可视化处理。

伦理标准
所有C57BL/6J雌性小鼠（6-8周龄）均由北京维泰尔实验动物技术有限公司提供。所有体内实验均遵循机构动物护理和使用委员会的指导原则，并已获得广西师范大学动物伦理委员会的批准（编号GXNU-IACUC-202511-002）。我们在实验中尽最大努力减少动物的痛苦，并控制所用动物数量。人类非小细胞肺癌A549细胞及相关数据均可在本文及补充材料中找到。如需更多数据，可向相应作者提出合理请求。

数据可用性
所有支持本研究结果的数据均包含在本文及补充材料中。如有额外数据需求，可向相应作者咨询。

利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。

致谢
本研究得到了国家自然科学基金（22407031）、广西自然科学基金青年基金（2024GXNSFBA010256）、国家自然科学基金（22377018）、广西百色学院学者计划、广西科技计划（GUIKE AD25069038）以及广西青年人才发展计划的资助。