《Biomaterials》：Functional characterization of obesity using advanced 3D in vitro adipose tissue models
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肥胖是一种复杂的全身性疾病，导致了全球代谢综合征的流行，然而研究人员对脂肪组织中驱动肥胖的潜在机制的理解仍然有限。作为热量摄入增加的主要细胞靶点，脂肪细胞经历剧烈的形态和功能变化，从而引发全身代谢功能障碍。为了在体外研究功能失调的肥胖脂肪细胞表型，革命性的三维
肥胖是一种复杂的全身性疾病，导致了全球代谢综合征的流行，然而研究人员对脂肪组织中驱动肥胖的潜在机制的理解仍然有限。作为热量摄入增加的主要细胞靶点，脂肪细胞经历剧烈的形态和功能变化，从而引发全身代谢功能障碍。为了在体外研究功能失调的肥胖脂肪细胞表型，革命性的三维（3D）脂肪细胞模型已被证明能够独特地重现肥胖特征性的充满脂质、肥大的脂肪细胞。这一特性使得3D体外平台成为传统二维单层系统的有力替代方案，在传统二维系统中，大型、球形且易漂浮的脂肪细胞容易脱落。这些复杂的3D体外新方法论（NAMs）现在使研究人员能够通过多种功能分析来剖析肥胖的多因素性质，这些分析验证了个体疾病标志并评估了治疗干预措施。然而，该领域面临一个关键挑战：将多种疾病相关读数整合为整体的解释，从而揭示新的脂肪细胞靶向机制。本综述提供了前沿3D脂肪组织系统的全面路线图，展示了这些NAMs如何能够革新肥胖研究中的生物学和药物靶点发现。研究人员审视了定义这些模型能力的功能分析，解决了关键的解读挑战，并探索了通过高通量方法和可扩展的功能平台来增强其影响的机会，这些平台将加速下一代肥胖疗法的开发。
**3. 健康与肥胖中的脂肪组织**
**3.1. 健康脂肪组织的标志**
人体白色脂肪组织主要包含两个储存库：内脏脂肪组织（visceral adipose tissue）和皮下脂肪组织（subcutaneous adipose tissue）。从体积上看，脂肪组织主要由白色脂肪组织组成，其直径范围约为20 μm至150 μm。当需要储存多余脂质时，脂肪组织驻留的祖细胞可以生成新的成熟脂肪细胞，这一过程由转录因子如CEBPα和PPARγ表达的增加启动。这个过程称为增生（hyperplasia），是一种健康反应，最终导致脂肪细胞储存容量的扩大。白色脂肪细胞的一个关键功能是其动态脂质储存作用。健康的白色脂肪细胞在胰岛素刺激下或通过被动扩散摄取脂肪酸和葡萄糖，随后转化为甘油三酯并储存在脂滴细胞器中。当能量需求增加时，β-肾上腺素能信号刺激脂肪细胞将甘油三酯水解为脂肪酸和甘油，并通过脂解作用（lipolysis）将其分泌回血液中。除了在动态脂质储存和释放中的重要作用外，脂肪细胞还被认为是高度分泌性的细胞。在发现瘦素（leptin，一种调节饱腹感的脂肪细胞特异性激素）之后，许多脂肪因子（adipokines，由脂肪组织产生的细胞因子）已被认识到在调节炎症、胰岛素敏感性、脂质积累和脂肪生成方面具有内分泌和旁分泌功能。除了脂肪细胞和脂肪祖细胞，脂肪组织还包含内皮细胞、神经细胞和免疫细胞，这些细胞对维持健康脂肪组织至关重要。白色脂肪组织高度血管化，这对于向器官提供营养、氧气以及循环中的细胞因子和激素至关重要。脂肪组织中复杂的交感神经和感觉神经网络参与了脂质储存、脂解作用和脂肪生成。白色脂肪组织也是驻留免疫细胞的家园，这些细胞提供了最大部分的细胞因子分泌。
**3.2. 肥胖脂肪组织的标志**
**脂肪细胞肥大、耗竭和异位脂质沉积**：在肥胖中，慢性过度的营养摄入导致甘油三酯储存需求增加，从而产生肥大的脂肪细胞。在肥胖期间，脂肪组织主要通过脂肪细胞肥大（hypertrophy）而非增生来扩大体积。脂肪细胞祖细胞分化导致的脂肪细胞更新使总脂肪细胞数量保持稳定或略有增加，但由于祖细胞的克隆扩增潜力有限，随着时间的推移会耗尽祖细胞池，这说明了脂肪细胞增生的局限性。因此，单个脂肪细胞的可塑性对于增加脂肪细胞大小至关重要，这种增加起缓冲作用以吸收并安全储存多余的能量。然而，当脂肪细胞的储存能力最终耗尽时，脂质溢出导致脂质沉积在其他组织如心脏、肝脏和骨骼肌中，引起脂毒性（lipotoxicity）。这体现在脂质代谢物和脂质中间体如神经酰胺和酰基肉碱导致氧化应激、胰岛素抵抗和骨骼肌再生受损。肥胖中脂肪细胞可塑性与脂毒性之间的一个有趣关系是通过激活CIDE家族蛋白CIDEA、CIDEB和CIDEC/FSP27来调节脂滴大小。CIDE家族蛋白通过增大脂滴大小参与甘油三酯储存的生物发生、成熟和调节。已观察到皮下脂肪组织中高CIDEA mRNA表达与肥胖患者的胰岛素敏感性相关。这表明CIDE家族蛋白通过允许大脂肪细胞大小来防止脂肪细胞脂质储存耗竭，进而保护免受其他组织如骨骼肌中高水平异位脂质沉积的影响。此外，这提示肥厚脂肪细胞的甘油三酯储存能力耗竭，而非肥大本身，是全身代谢综合征的主要驱动因素。
**缺氧**：肥胖脂肪组织中的肥大脂肪细胞被认为会超出血管供应，从而产生局部缺氧区域。缺氧诱导内质网中的未折叠蛋白反应，导致蛋白质翻译抑制、内质网降解、高水平的活性氧（ROS）和凋亡。脂肪组织中缺氧导致脂联素（adiponectin）产生和分泌减少，从而降低其胰岛素增敏和抗炎作用。脂肪细胞响应缺氧而增加促炎细胞因子的分泌，影响全身胰岛素敏感性，引发胰岛素抵抗和2型糖尿病。缺氧水平升高和HIF-1活性增加与胶原沉积增加相关，并诱导促炎和纤维化反应，导致脂肪组织功能障碍。
**纤维化**：对肥胖人脂肪组织外植体的组织学分析显示，与瘦型脂肪组织相比，纤维化水平增加，主要位于细胞周围环境。在人类肥胖脂肪组织中，被细胞周围纤维化包围的脂肪细胞体积较小，这表明脂肪细胞的细胞周围纤维化可能有助于限制肥胖中脂肪细胞的扩张。细胞外基质（ECM）分子的差异表达已被认为在需要增加脂质储存时限制脂肪细胞扩张能力。例如，具有高水平胶原6a3和赖氨酸氧化酶以及低水平弹性蛋白的肥胖脂肪组织显示较小的脂肪细胞大小，但代谢特征更差。通过机械性脂肪细胞变形显示的脂肪细胞功能障碍迹象表明，基质稳定性和刚性可能在力学敏感信号传导中发挥作用，导致功能障碍的脂肪细胞表型。虽然纤维化和促炎信号通常相关，但在小鼠和人类受试者的不同研究表明，脂肪组织纤维化发生在营养过载的早期阶段，先于促炎信号。
**免疫细胞浸润和慢性炎症**：在肥胖脂肪组织中，促炎细胞因子分泌增加与抗炎激素脂联素产生减少相结合，导致巨噬细胞浸润和全身性低度炎症。虽然脂肪细胞是高度分泌性的细胞，表达多种促炎细胞因子，但脂肪组织分泌的大部分炎症细胞因子来自前脂肪细胞和驻留或浸润的巨噬细胞。脂肪组织炎症的一个重要贡献者是缺氧，这由缺氧诱导因子-1（HIF-1）介导的脂肪细胞源性促炎细胞因子如白细胞介素-6（IL-6）和巨噬细胞迁移抑制因子样蛋白-1（MIF-1）的分泌所提示。随后巨噬细胞的浸润可能促进炎症反应的进一步发展。小鼠脂肪组织切片组织学显示，在称为“冠状结构”的区域中，大量巨噬细胞包围坏死脂肪细胞。这些结构在缺氧脂肪组织中更为普遍，表明缺氧参与脂肪细胞坏死和随后的巨噬细胞浸润。促炎信号通路的几个组分如TNFα、JNK和NF-κB也与胰岛素敏感性有关。脂肪细胞响应缺氧而增加促炎细胞因子的分泌，影响全身胰岛素敏感性，引发胰岛素抵抗和2型糖尿病。
**胰岛素抵抗**：脂肪细胞中的胰岛素信号对于摄取葡萄糖和脂质并将其以甘油三酯形式安全储存在脂滴中至关重要。脂肪细胞中的胰岛素抵抗会增加循环中葡萄糖和脂质的水平，导致高血糖、高脂血症和异位脂质沉积。有几种过程被认为导致肥胖脂肪细胞胰岛素敏感性降低。脂联素产生和分泌的减少导致其胰岛素增敏作用减弱。肥胖脂肪组织分泌TNFα增加，部分通过减少胰岛素信号来增加脂解作用。此外，脂肪细胞肥大已被证明是胰岛素抵抗的直接原因，通过破坏胰岛素信号下葡萄糖转运蛋白向质膜的转运。
**抵抗代谢综合征**：肥胖中脂肪组织功能障碍的所有这些特征都可能导致代谢综合征的发展。代谢综合征通常由全身性胰岛素抵抗、高血糖和高脂血症、腰围增加和高血压定义，显著增加多种癌症、骨关节炎、心血管疾病和2型糖尿病的发病风险。然而，相当一部分肥胖个体至少在与肥胖发展的最初阶段免受代谢综合征的影响。这些个体保持胰岛素敏感，且在其他器官中几乎没有异位脂肪沉积。此外，他们的脂肪组织扩张以脂肪细胞增生而非肥大为特征。在增生过程中，持续的脂肪生成允许在较小的脂肪细胞中充分储存甘油三酯，避免异位脂质沉积和胰岛素抵抗。与来自肥胖代谢综合征个体的肥大脂肪细胞相比，这些小的脂肪细胞显示出与ECM重塑和炎症相关基因的表达降低。在健康的增生性脂肪组织中，毛细血管密度和血流量足以在30-80 mmHg的氧张力下为组织提供氧气和营养，而肥胖脂肪组织中的氧张力、灌注率和耗氧量均降低。这使注意力从总脂肪组织体积转向由于脂肪细胞大小扩张不足而导致的健康脂肪细胞功能丧失，认为这是肥胖个体发生代谢综合征的原因。提高对脂肪组织和脂肪细胞功能障碍的理解将有助于开发预防代谢综合征的疗法。
**4. 脂肪组织与肥胖的体外模型**
**4.1. 常见细胞来源**：为了开发脂肪组织的体外模型，大多数研究使用小鼠胚胎成纤维细胞衍生细胞系，如3T3-L1、3T3-F442A，以及最近可用于体外分化研究脂肪生成的OP9细胞。特别是3T3-L1细胞已被更广泛地表征和研究，使得不同研究之间能够更好比较，这可能是其持续广泛使用的原因。然而，使用这些小鼠衍生细胞的最显著缺点是它们对人间脂肪细胞功能和肥胖疾病机制的代表性有限。虽然许多机制在物种间是保守的，但已知几种通路如与脂肪生成启动相关的通路在小鼠和人类脂肪细胞中的调控方式不同，这凸显了人类细胞来源用于体外疾病建模的重要性。虽然不同研究组已研究了使人类脂肪源性祖细胞永生的可能性，但这类细胞系尚未被广泛采用。这或许源于永生化人类脂肪祖细胞在展示前脂肪细胞特征方面的成功程度不一，或者该领域更倾向于使用更具生物学相关性的原代细胞来源。原代脂肪祖细胞，如脂肪组织驻留的间充质基质细胞（AD-MSCs）和前脂肪细胞，还可以辅助旨在发现患者群体特异性疗法的精准医学研究，并且由于已建立的原代祖细胞分离方案而大量可用。在几种脂肪生成诱导组分如胰岛素以及增加糖皮质激素信号和升高细胞内cAMP水平的因子的作用下，这些脂肪祖细胞可以在体外分化为脂肪细胞，并保持供体和储存库特异性特征。一种人类前脂肪细胞来源是Simpson-Golabi-Behmel综合征（SGBS）细胞，源自一名患有SGBS遗传性疾病的男性患者。这些细胞的特征是无需永生化即可在体外具有延长的增殖和分化能力，且几乎无限可用，使SGBS细胞成为最具细胞系样特性的人类脂肪细胞祖细胞来源。虽然脂肪细胞祖细胞可以在体外有效增殖和分化，但这些细胞并不表现出与体内成熟脂肪细胞相同的功能特征。体外分化的脂肪细胞无论在组织培养塑料上还是在柔软的胶原I水凝胶中培养，都表现出多房性脂滴形态，以及PPARγ和脂联素基因表达、瘦素分泌和基础脂解作用相比单房性成熟脂肪细胞的降低。为了克服这种对体内脂肪细胞生物学的不完全重现，不同研究组选择使用成熟的原代脂肪细胞在体外研究肥胖。然而，成熟脂肪细胞的高脂质含量和脆弱性阻止了它们冷冻保存后的培养，并且其浮力阻止了沉降和贴壁，限制了它们在体外模型中的持续使用。为了解决这个问题，一些研究描述了创新的培养系统，以在长期体外培养过程中维持患者来源的成熟脂肪细胞，同时保持其疾病样特征。
**4.3. 3D培养系统**：为了解决2D单层培养在体外研究肥胖中的局限性，不同研究组开发了3D培养系统。为了评估用于开发这些模型的策略趋势，本研究组在表1中编制了一个全面但非详尽的资源集合。本部分描述了用于开发3D体外脂肪组织模型的不同策略、它们的优势、局限性和剩余挑战。
**无支架培养系统**：无支架3D培养系统利用细胞在缺乏外源性支架材料的情况下自聚集的固有特性。这些细胞聚集体通过细胞自身分泌的ECM分子稳定，形成完全由组织天然组成成分构成的微环境，可能更好地模拟体内条件。这些聚集体在文献中被称为类器官或球体。类器官需要多种细胞类型的自组织系统以重现组织的独特结构。本研究组认为本综述中描述的细胞聚集体尽管是多细胞的，但缺乏自组织，因此应称为球体。无支架方法无需掺入ECM分子，使其相对易于建立，因此该策略常用于3D脂肪组织模型开发。虽然无支架球体培养易于组装且与2D培养系统相比具有更高的生理相关性，但在精确控制球体形成的大小、细胞密度和空间细胞组织方面仍存在挑战。由于球体致密紧凑的结构阻碍了其核心的直接成像，通常需要石蜡包埋和切片来染色和成像球体横截面。此外，随着球体大小和密度的增加，由缺氧、限制性营养扩散和废物积累驱动的坏死核心形成更为普遍，导致球体核心内部脂肪生成不理想。值得注意的是，从那些开发用于重建的脂肪组织移植物的研究中可以学到有趣的教训。例如，通过将体外分化的脂肪细胞薄片叠成更厚的3D结构，研究人员防止了坏死和缺氧核心的形成，同时成功地将移植物与宿主网络整合。
**基于支架的培养系统**：基于支架的3D培养系统利用生物材料的机械、生化和物理特性来锚定或包裹细胞，从而实现3D结构的形成。这些系统的一个关键优势是能够精细调节支架特性和组织结构以模拟体内组织特征（健康或患病），或探索这些特性对脂肪生成和脂肪细胞行为的影响。这些可调特性的价值体现在基于支架的技术在3D脂肪组织建模研究中的普遍性。创建基于支架的3D脂肪细胞培养的一种策略是将细胞浸润到多孔支架内，以促进在3D结构内的附着和组织。与为细胞簇提供锚定的多孔支架不同，基于水凝胶的支架广泛用于包裹细胞并提供3D基质支持环境。鉴于胶原I是白色脂肪组织中的主要ECM蛋白，它已成为许多研究中特别受欢迎的支架材料选择。然而，外源性基质分子的引入可能并不适合所有应用。本研究课题组开发了一种方法，将水凝胶-AD-MSC混合物浸润到薄而高度多孔的纤维素支架中，创建具有一致尺寸和约60 μm厚度的结构，以避免组织梯度或坏死核心的形成，同时便于成像。或者，利用脱细胞肺基质的ECM结构使脂肪支架血管化的策略产生了功能齐全的血管化脂肪组织构建体，为模型内部空间提供氧气。这些研究证明了多孔支架或水凝胶支架基脂肪组织模型的可调结构在克服体外脂肪组织模型重要局限性方面的优势。
**微流控模型**：微流控模型引入灌注以创建更具生理相关性的组织模型，通过为细胞提供机械信号并控制微环境中的营养、废物、信号分子和氧气水平。虽然器官芯片技术已针对各种组织广泛开发，但脂肪组织芯片受到的关注相对较少。微流控模型的应用凸显了3D微流控模型在研究脂肪组织对能量可用性波动或脂解刺激的动态反应方面的潜力，这些是肥胖中的关键代谢过程，只能基于灌注的系统模拟。在微流控模型中，直接灌注脂肪细胞可能会导致对脆弱脂肪细胞产生高且非生理性的剪切力，这在体内不会发生。为了缓解这一问题，不同研究组开发了间接灌注模型，其中水凝胶包裹的原代成熟脂肪细胞在微流控腔内受到多孔膜（充当类似血管的屏障）的保护而免受剪切应力。这些持续应用微流控技术进行3D脂肪组织建模的努力表明，肥胖等全身性疾病是多器官芯片研究的高度相关应用，为未来的进展提供了重要前景。
