基于动态模态分解的人类星形胶质细胞中类固醇诱导的Ca2＋信号传导的单细胞分析

《Cell Calcium》：Single-cell analysis of sterol-induced Ca2＋ signaling in human astrocytes by dynamic mode decomposition

　　米克拉斯·P.W.拉尔森|莱娜·劳里森|阿曼达·T.保利|拉斯穆斯·詹森|拉尔夫·齐默尔曼|马克斯·莱曼|帕布罗·韦西格|丹尼尔·维斯特纳
丹麦南丹麦大学生物化学与分子生物学系，Campusvej 55，DK-5230，奥登塞M，丹麦

摘要
星形胶质细胞中的Ca2+信号传导是大脑中细胞间通信的核心机制，对调节神经元兴奋性、突触可塑性以及能量代谢起着关键作用。星形胶质细胞的Ca2+动态失衡是神经退行性疾病的特征之一，而胆固醇的运输与代谢异常也会影响膜的结构与功能，因为胆固醇对维持这些功能至关重要。尽管近期研究开始探索星形胶质细胞中Ca2+信号传导与类固醇稳态之间的关联，但目前针对胆固醇及相关类固醇如何调控星形胶质细胞Ca2+动态的无偏分析方法及机制理解仍十分有限。本研究采用动态模式分解技术，对通过人类星形胶质细胞延时成像获得的Ca2+信号进行解析与分类。通过合成数据与实验数据集的对比，我们发现结合聚类的延迟嵌入动态模式分解技术能够将不同的Ca2+活动状态区分开来。分析结果表明，胆固醇水平升高会促使星形胶质细胞进入更活跃的振荡状态，而急性胆固醇缺乏则会抑制Ca2+活性。此外，用24-、25-和27-羟基胆固醇等氧化甾醇处理后，胆固醇引发的Ca2+振荡也会被抑制。总体而言，本研究提出了一种用于分解和分析复杂时空Ca2+信号的通用计算框架，可广泛应用于细胞生物学领域的定量成像研究。

引言
星形胶质细胞是中枢神经系统中最常见的胶质细胞类型，对大脑功能及细胞间通信起着至关重要的作用[1]、[2]。虽然星形胶质细胞本身不具备电兴奋性，但它们可通过细胞内钙离子（Ca2+）水平的动态变化表现出某种形式的兴奋性[3]。这种Ca2+浓度上升会激活下游信号通路，使星形胶质细胞能够调节神经元活动、血管张力以及周围胶质细胞的行为[4]、[5]、[6]。通过Ca2+介导的信号传导，星形胶质细胞能够维持大脑的稳态，而这些信号通路的紊乱则与阿尔茨海默病、帕金森病以及多发性硬化症等神经退行性疾病密切相关[3]、[3]、[7]、[8]、[9]。

星形胶质细胞的Ca2+信号传导依赖于膜的特性以及离子通道的功能，而这些又深受脂质成分的影响，尤其是胆固醇——作为一种重要的结构与调控成分，胆固醇能够影响离子通道及受体的活性[10]、[11]。在中枢神经系统中，星形胶质细胞是胆固醇的主要来源与分配者，而星形胶质细胞中胆固醇代谢的紊乱则是神经退行性疾病的早期特征之一[12]、[13]。尽管已知胆固醇及其氧化衍生物（氧化甾醇）能够改变其他细胞类型中的Ca2+内流及膜兴奋性，但它们对星形胶质细胞Ca2+动态的具体影响至今仍未得到充分研究[14]、[15]、[16]。

星形胶质细胞Ca2+信号传导的一个显著特点是其在单细胞层面的时空异质性[17]、[18]。不同的星形胶质细胞可能会呈现短暂的单次钙离子峰值、持续的Ca2+浓度上升、低频振荡或反复出现的钙离子爆发，而这些信号还可能以细胞间Ca2+波的形式在星形胶质细胞网络中传播[19]、[20]、[21]。即便处于相同的环境中，不同细胞的行为也往往存在差异：有的细胞会产生快速的钙离子峰值，而相邻的细胞可能仅出现缓慢振荡或完全没有振荡现象。这种多样性源于细胞处理钙离子机制的细微差别，以及通过间隙连接和细胞外信号分子进行的交流[20]、[22]、[23]。虽然这种异质性的Ca2+动态为星形胶质细胞提供了多种信号传递方式，但也使得在单细胞及群体层面进行定量分析变得困难。

要理解这种异质性，就需要具备能够同时追踪数百个星形胶质细胞的大规模单细胞Ca2+成像技术。然而，大多数传统的Ca2+成像研究都受到视野范围小、数据采集效率低的限制，通常一次只能观察数十个细胞。这些局限性不仅阻碍了对细胞群体整体行为的分析，也无法完整呈现单个细胞在星形胶质细胞群体中的反应分布。此外，传统的分析方法往往依赖基于阈值的峰值检测或简单的ΔF/F0指标，这类方法会忽略振荡频率、阻尼程度以及同步性等反映不同Ca2+信号传导特征的时空结构信息。因此，迫切需要一种能够以无偏方式分解复杂Ca2+信号，并对大量星形胶质细胞群体中的不同动态状态进行分类的计算方法。

为克服这些限制，我们开发了一套大规模单细胞Ca2+成像与计算分析框架，可用于定量描述星形胶质细胞Ca2+信号的异质性。该框架采用高灵敏度的Ca2+指示剂Cal-520 AM与宽场荧光显微镜相结合，能够在每次成像中从数百个细胞获取高分辨率的数据，同时具备出色的信噪比，还能最大限度地减少染料带来的缓冲效应。与Fluo-4等传统指示剂相比，Cal-520具有更高的亮度与更好的信号保持能力，这有助于在庞大的细胞群体中准确检测到微弱的Ca2+瞬变信号[24]。在通过深度学习技术从延时成像数据中分离出单个星形胶质细胞后，我们再运用动态模式分解技术来分析Ca2+信号。动态模式分解是一种数据驱动的矩阵分解方法，能够对复杂的时空动态过程进行线性近似[25]。这一技术最初源自流体动力学领域，后来已被成功应用于包括磁共振成像、正电子发射断层扫描、脑电图记录以及活细胞荧光显微镜在内的多种生物医学数据分析中[26]、[27]、[28]、[29]、[30]、[31]、[32]、[33]、[34]、[35]、[36]、[37]。在此基础上，我们采用了动态模式分解的变体，对在受控胆固醇加载、胆固醇缺乏以及氧化甾醇处理条件下的人类星形胶质细胞中的单细胞Ca2+振荡进行分解与分类，从而将这些细胞按照振荡模式划分为不同的组别，以便进一步分析。我们所采用的高通量单细胞分析方法既能够捕捉星形胶质细胞网络中的常见反应模式，也能识别那些罕见的、空间上局部发生的事件，进而实现对群体异质性的定量分析。

总体而言，我们提出了一种全新的星形胶质细胞成像与计算分析框架，该框架能够定量描述复杂的Ca2+信号传导动态，并揭示类固醇成分如何影响不同的Ca2+活动状态。

片段摘录
细胞培养
采用SV40大T抗原永生化处理的正常人类星形胶质细胞（产品编号P10251-IM，Innoprot）被培养在T25培养瓶中（Nunc EasYFlask，编号156367，Thermo Fisher Scientific），培养温度为37℃，置于含有5%二氧化碳的湿化培养箱中。这些细胞在专门的星形胶质细胞培养基中生长（产品编号Astrocyte Medium，AM；编号P60101，Innoprot），该培养基每2–3天更换一次。通过光学显微镜每日监测细胞的生长情况以及是否存在污染现象。当细胞培养达到90%融合度时，通过冲洗的方式将细胞分离出来。

动态模式分解与模拟Ca2+动态的时间序列分类
在验证机器学习算法性能时，通常会使用合成数据，我们便采用了一个简单且成熟的星形胶质细胞Ca2+振荡模型来评估我们方法的性能。该模型基于非线性常微分方程，能够模拟产生星形胶质细胞Ca2+振荡所需的核心要素[46]、[47]，其中包括内质网中的肌醇-1,4,5-三磷酸受体（IP3R），该受体负责释放IP3。

讨论
在本研究中，我们结合大规模单细胞Ca2+成像技术与基于动态模式分解的时间序列分析方法，研究了胆固醇水平变化如何影响星形胶质细胞的Ca2+信号传导。通过模拟数据以及来自人类星形胶质细胞的实验数据，我们证明了该方法能够将不同的Ca2+信号分解为不同的类别，并将这些类别与胆固醇含量的具体变化联系起来。我们的研究结果表明，细胞膜中的胆固醇水平起着至关重要的作用。

结论
在本研究中，我们建立了一套高通量的实验与计算分析框架，可用于量化星形胶质细胞Ca2+动态的异质性，同时确定胆固醇成分的变化如何影响这些信号传导状态。通过将宽场Ca2+成像技术、基于深度学习的单细胞分割技术以及动态模式分解-时间延迟演化方法相结合，我们能够同时解析数百个单个星形胶质细胞中的不同Ca2+活动时间模式。该方法成功地对各类Ca2+活动模式进行了分类。

CRediT作者贡献说明
米克拉斯·P.W.拉尔森：撰写原始稿件、可视化处理、方法设计、实验实施、正式分析、数据整理。
莱娜·劳里森：撰写原始稿件、研究指导、数据整理。
阿曼达·T.保利：数据整理、实验实施。
拉斯穆斯·詹森：撰写原始稿件、软件应用、正式分析。
拉尔夫·齐默尔曼：审核与编辑原始稿件、研究指导、概念构思。
马克斯·莱曼：方法设计、资源提供。
帕布罗·韦西格：方法设计、资源提供。
丹尼尔·维斯特纳：审核与编辑原始稿件。

代码可用性
用于动态模式分解-时间延迟演化分析、数据聚类以及图表生成的所有代码均公开发布在以下地址：https://github.com/Miklaspwl/dmd-tde-calcium-analysis

未引用参考文献
[81]、[82]、[83]

利益冲突声明
作者声明自己不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢
本研究得到了卡尔斯堡基金会（资助编号CF23-1086）以及伦德贝克基金会（资助编号R366-453 2021-226）的支持。我们还要感谢DaMBIC成像设施所提供的显微镜相关设备支持（由诺和诺德基金会提供资助，资助编号NNF18SA0032928）。