《Cellular Signalling》：NSUN2 integrates glucose and one?carbon metabolism upstream of Rag GTPase-dependent mTORC1 signaling
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Xueyi Chen|Li Xiao|Yiying Zhou|Zeyu Wu|Xu Xu|Tao Qiu|Rui Chen中国武汉430071，武汉大学泰康医学院（基础医学科学学院），湖北省发育起源疾病重点实验室摘要葡萄糖与一碳代谢如何影响Rag GTP酶依赖的雷帕霉素复合物1（
Xueyi Chen|Li Xiao|Yiying Zhou|Zeyu Wu|Xu Xu|Tao Qiu|Rui Chen
中国武汉430071，武汉大学泰康医学院（基础医学科学学院），湖北省发育起源疾病重点实验室
摘要
葡萄糖与一碳代谢如何影响Rag GTP酶依赖的雷帕霉素复合物1（mTORC1）功能，目前尚不完全清楚，尤其是在缺乏AMPK的情况下。本研究通过CRISPR编辑、拯救实验、蛋白质组学、热稳定性分析以及RNA测序，绘制出了人类细胞中一种不依赖于AMPK的葡萄糖反应途径。在AMPK缺失的人类细胞中，重新摄入葡萄糖会迅速重新激活mTORC1，而对mTORC1相关复合物的蛋白质组分析表明NSUN2是一种与葡萄糖相关的因子。去除NSUN2会显著降低葡萄糖诱导的mTORC1激活，而重新表达该蛋白则可恢复这一效应。基因分析显示NSUN2位于溶酶体Rag模块的上游，因为持续活性的Rag GTP酶可以绕过NSUN2的缺失。结构-功能研究显示，NSUN2的急性信号传导功能主要与其催化半胱氨酸无关，但需要一个N端的营养响应基序以及一个预测的S-腺苷甲硫氨酸（SAM）响应序列。SAM能够提高野生型NSUN2的热稳定性，而蛋白质组学和免疫沉淀实验发现，能够产生SAM的酶——甲硫氨酸腺苷转移酶2A（MAT2A）是NSUN2的葡萄糖响应伴侣。MAT2A基因敲除后会重现信号传导缺陷。转录组学进一步将NSUN2与蛋白质稳态、分泌功能以及应激适应中的葡萄糖响应机制联系起来。这些研究结果表明，NSUN2是一种非经典的信号因子，它将葡萄糖和甲基供体的可用性与Rag依赖的mTORC1调控及转录适应性相连接。
引言
mTORC1能够响应营养物质和生长信号，协调合成生长、生物合成以及自噬抑制过程[1]。由Rag GTP酶、Ragulator以及相关的GATOR和KICSTOR调节因子组成的溶酶体信号模块，会将mTORC1招募到溶酶体中，随后Rheb会在那里激活该复合物[2]、[3]、[4]、[5]。尽管这一通路中的氨基酸感知机制已被广泛研究，但葡萄糖对mTORC1的调控机制则更为复杂。葡萄糖缺乏可通过醛缩酶-AXIN信号通路抑制mTORC1，而糖酵解中间产物二羟丙酮磷酸则可以在不依赖AMPK的情况下促进mTORC1的激活[6]、[7]、[8]。甲硫氨酸和一碳代谢也通过SAM传感器SAMTOR与Rag轴相连[9]。综上所述，多种代谢物依赖的机制都会影响溶酶体中的mTORC1，但将葡萄糖与甲基供体可用性相互关联的节点尚未完全明确。
NSUN2是一种胞嘧啶-5 RNA甲基转移酶，能够修饰tRNA和mRNA，已被认为与mRNA稳定性、核输出、应激适应以及代谢调控有关[10]、[11]、[12]、[13]。这些功能表明，NSUN2可能以比传统RNA修饰酶更直接的方式影响营养物质感知。不过，NSUN2是否参与葡萄糖依赖的mTORC1快速调控机制，目前尚未得到验证。
在本研究中，我们在AMPKα1/2双基因敲除的人类细胞中，结合了CRISPR遗传学技术、拯救实验、蛋白质组学、CETSA分析以及转录组学方法，从而确定了不依赖于AMPK的葡萄糖反应途径。我们发现，NSUN2是葡萄糖重新摄入后mTORC1快速重新激活所必需的，它位于溶酶体Rag模块的上游，能够以葡萄糖响应的方式与MAT2A结合，并将急性生化信号传导与下游的转录重塑过程相连接。出乎意料的是，即使在催化功能丧失的NSUN2突变体中，大部分相关功能依然存在，这表明其信号传导功能主要依赖于非催化途径。
章节节选
材料
抗体。本研究中使用的抗体包括：抗-FLAG抗体（Sigma，编号F1804；RRID：
AB_262044；在免疫印迹实验中的稀释比例为1:3000）；抗-HA抗体（Cell Signaling Technology，编号2999S；RRID：
AB_1264166；稀释比例为1:2000）；抗-phospho-S6K1抗体（Cell Signaling Technology，编号9234 L；RRID：
AB_2269803；稀释比例为1:1500）；抗-S6K1抗体（Cell Signaling Technology，编号9202S；RRID：
AB_331676；稀释比例为1:2000）；抗-AMPKα抗体（Cell Signaling Technology，编号2532S；RRID：
AB_330331；稀释比例为1:5000）；抗-phospho-AMPKα抗体（Cell Signaling Technology，编号2535S；RRID：
AB_331250；稀释比例为1:5000）。
NSUN2是mTORC1激活中不依赖于AMPK的葡萄糖作用途径所必需的
在两个独立的AMPKα1/2双基因敲除细胞系中，4小时的葡萄糖缺乏会抑制phospho-S6K1的表达，而20分钟的葡萄糖重新摄入则可使其恢复，这表明即使没有AMPK的催化亚基，葡萄糖仍能快速影响mTORC1的功能（见图1A）。为了找出这一过程的介导因子，我们通过LC-MS/MS技术分析了FLAG-RAPTOR的免疫沉淀产物。在筛选出的相互作用分子中，NSUN2在两次生物学重复实验中，分别通过12种和8种肽段被反复检测到，同时
讨论
我们的研究结果表明，NSUN2是Rag依赖的mTORC1上游营养感知机制中一个此前未被发现的组分。现有的模型主要关注溶酶体中的氨基酸感知、葡萄糖缺乏时激活的醛缩酶-AXIN信号通路、作为葡萄糖衍生代谢信号的DHAP，以及作为甲硫氨酸/SAM状态传感器的SAMTOR[1]、[2]、[3]、[4]、[5]、[6]。本研究将NSUN2纳入这一网络，表明葡萄糖的可用性与甲基供体代谢是通过某种机制相互关联的。
结论
总之，NSUN2是实现mTORC1不受AMPK调控而因葡萄糖激活所必需的，它位于Rag GTP酶的上游。其急性信号传导功能主要依赖于特定的营养响应基序以及与MAT2A相关的甲基供体耦合机制，而非传统的催化半胱氨酸功能。这些发现揭示了一种以NSUN2为核心的机制，该机制将葡萄糖和SAM的可用性与溶酶体中的mTORC1调控及适应性转录重塑过程相连接。
CRediT作者贡献说明
Xueyi Chen：撰写原始稿件、开展研究、进行正式分析、负责数据整理。Li Xiao：撰写原始稿件、开展研究、进行正式分析、负责数据整理。Yiying Zhou：开展研究、进行正式分析、负责数据整理。Zeyu Wu：撰写原始稿件、开展研究、进行正式分析、负责数据整理。Xu Xu：负责审稿与编辑、提供指导、参与概念设计。Tao Qiu：负责审稿与编辑、提供指导、协调资源、参与概念设计。Rui Chen：负责审稿与编辑，
致谢
本研究得到了中国国家自然科学基金的支持（项目编号为32470756和32170720）。
