在血管平滑肌细胞的成骨表型转化过程中，H3K18la-ALKBH5-Runx2-LDHA正反馈循环会促进血管钙化

《Cellular Signalling》：An H3K18la-ALKBH5-Runx2-LDHA positive feedback loop promotes vascular calcification in the osteogenic phenotypic transition of vascular smooth muscle cells

　　

邓一凡|陈静|孙勤宇|冯英杰|朱丽|沈伟刚|周伟|张静

中国扬州225001，扬州大学附属江苏省北部人民医院

摘要

血管平滑肌细胞的成骨表型转变是血管钙化发生与进展的核心病理机制。作为关键的成骨转录因子，Runt相关转录因子2可诱导血管平滑肌细胞向类成骨细胞表型转变，进而促进血管壁中钙盐沉积及钙化斑块的形成。然而，其上下游调控网络至今尚未完全明确。本研究发现，钙化主动脉组织以及具有成骨特性的血管平滑肌细胞中乳酸水平升高，同时整体蛋白质乳酰化程度以及组蛋白H3第18位赖氨酸的乳酰化水平也同步上升。在血管平滑肌细胞中，乳酸能够持续增强H3K18位赖氨酸的乳酰化修饰及成骨表型转变，而糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖则可逆转这些表型改变。与上述表型变化相一致，通过CUT&Tag技术结合蛋白质组学分析，我们发现AlkB同源物5可能是H3K18位赖氨酸修饰的潜在转录靶标。H3K18位赖氨酸修饰在ALKBH5基因的启动子区域富集，而该基因的表达对于激活H3K18位赖氨酸修饰所调控的基因至关重要。机制研究显示，Runx2是ALKBH5介导的m⁶A去甲基化的下游靶标，ALKBH5通过去除Runx2 mRNA上的m⁶A修饰来上调其表达；相反，敲低ALKBH5会导致m⁶A过度积累，进而加速Runx2 mRNA的降解。此外，Runx2还能直接调控乳酸脱氢酶A的转录，从而增加乳酸生成及H3K18位赖氨酸修饰的水平，形成H3K18位赖氨酸修饰-ALKBH5-Runx2-乳酸脱氢酶A的正反馈循环，持续推动血管平滑肌细胞的成骨表型转变。本研究揭示了血管钙化发病机制中组蛋白乳酰化修饰与RNA m⁶A甲基化修饰之间的新型协同调控机制。

引言

血管钙化是一种以羟基磷灰石钙盐在血管内膜或中膜异常沉积为特征的病理病变。对于患有动脉粥样硬化、高血压、糖尿病和慢性肾病的患者而言，血管钙化是心血管死亡风险的独立重要预测因素[1]。推动血管钙化发生与进展的核心病理机制，是动脉中膜血管平滑肌细胞出现异常的成骨表型转变[2]。在生理状态下，血管平滑肌细胞保持收缩表型以维持血管稳态，而病理损伤会促使这些细胞从收缩表型转变为类成骨细胞表型。这种表型特征表现为内源性钙化信号通路的激活以及骨特异性蛋白表达水平的上升[3]。Runt相关转录因子2是调控成骨细胞分化及骨基质合成的关键转录因子，已被广泛认为是推动血管平滑肌细胞成骨转分化的核心因素[4]。Runx2可直接激活包括骨桥蛋白、骨钙素和碱性磷酸酶在内的多种成骨标志物，进而促进血管平滑肌细胞的成骨表型转变并推动钙盐沉积[5]、[6]。最新研究显示，小檗碱可通过调节Runx2的积累发挥保护心血管疾病的作用[7]。因此，深入探究血管平滑肌细胞成骨重编程过程中Runx2的调控机制，对于开发针对血管钙化的Runx2靶向生物疗法具有重要意义。

乳酸作为糖酵解过程中的核心代谢物，不仅是反映细胞代谢状态的重要指标，还能通过组蛋白乳酰化参与染色质重塑及转录调控，是连接代谢紊乱与表观遗传失调的关键纽带[8]。在各类乳酰化修饰中，组蛋白H3第18位赖氨酸的乳酰化修饰是最具代表性的标志物，它能直接促进下游靶基因的转录，同时影响细胞命运转变、炎症反应及病理重构过程[9]。近期研究显示，NR4A3介导的糖酵解增强及乳酸积累会提升H3K18位赖氨酸的修饰水平，进而加速动脉钙化进程[10]。不过，H3K18位赖氨酸在血管平滑肌细胞表型转变中的作用，以及它与Runx2异常过表达之间的关联，目前仍需进一步阐明。

在本研究中，我们证实具有成骨特性的血管平滑肌细胞中H3K18位赖氨酸的修饰水平异常升高。我们的数据表明，H3K18位赖氨酸可直接结合到AlkB同源物5的启动子区域，从而上调该基因的转录表达。ALKBH5是一种m⁶A去甲基化酶，它能去除Runx2 mRNA上的m⁶A修饰，进而提高Runx2的表达水平。此外，Runx2还可直接调控乳酸脱氢酶A的转录，后者又会增加乳酸生成并进一步提升H3K18位赖氨酸的修饰水平。总体而言，我们的研究结果强调了H3K18位赖氨酸修饰-ALKBH5-Runx2-乳酸脱氢酶A正反馈循环在推动血管平滑肌细胞成骨表型转变及钙化进程中的核心作用。

研究内容概述

细胞培养、模型建立、细胞转染及药物处理

大鼠主动脉平滑肌细胞A7r5购自上海中桥新洲生物技术有限公司，这些细胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的高糖DMEM培养基（产品编号PM150210，Procell公司生产）中培养，培养环境为温度37℃、含5%二氧化碳的湿润环境。

钙化模型（血管钙化组）是通过在含有10?mM β-甘油磷酸二钠水合物（产品编号T4915）的培养环境中培养血管平滑肌细胞来建立的，

钙化模型中整体乳酰化修饰水平及H3K18位赖氨酸修饰水平显著升高

对雄性SD大鼠进行为期3周的维生素D3腹腔注射后，通过茜素红和冯科萨染色方法观察，发现大鼠主动脉出现明显的中层钙化现象（见图S1 A?C）。Western blot检测及RT-qPCR分析结果显示，与正常对照组相比，无论是大鼠主动脉还是β-甘油磷酸诱导的血管平滑肌细胞钙化模型中，收缩标志物α-SMA的表达均下降，而成骨标志物Runx2和BMP2的表达则显著上升（见图S1D?F及I?K）。与之相符的是，

讨论

在本研究中，我们在血管钙化领域取得了三项相互关联的发现：首先，H3K18位赖氨酸修饰可转录激活m⁶A去甲基化酶ALKBH5；其次，ALKBH5介导的m⁶A去甲基化作用能够在IGF2BP2的调控下稳定Runx2 mRNA的表达，从而推动血管平滑肌细胞的成骨表型转变；第三，Runx2激活的乳酸脱氢酶A会促进乳酸生成，进而进一步强化H3K18位赖氨酸的修饰，形成自我放大的表观遗传调控环路。这些发现

作者贡献声明

邓一凡：论文撰写——初稿撰写、软件使用、资金获取、正式分析、数据整理、概念构思。 陈静：论文撰写——初稿撰写、方法学设计。 孙勤宇：论文撰写——初稿撰写、数据整理。 冯英杰：论文撰写——审阅与编辑、方法学设计。 朱丽：论文撰写——审阅与编辑、正式分析。 沈伟刚：论文撰写——审阅与编辑、初稿撰写、研究指导、软件使用、正式分析。 周伟：论文撰写——审阅与编辑。 张静：论文撰写——

伦理声明

本项动物实验及其处理方案已获得汉江生物技术有限公司动物实验伦理委员会的正式批准（批准编号HJSW-25101001，位于中国江苏）。

资助情况

本研究得到了江苏省研究生科研实践创新计划的财政支持（项目编号：SJCX24-2350）。

利益冲突声明

所有作者声明，他们不存在任何可能影响本研究结果的已知财务利益关联或个人关系。