《PLOS Genetics》：Multi-regional transcriptomic profiling reveals divergent molecular mechanisms in ALS-related neurodegeneration
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神经退行性疾病（包括肌萎缩侧索硬化症（ALS））在很大程度上仍未解决，其复杂的病因尚未完全阐明。家族性和散发性ALS病例中最常见的遗传原因是C9orf72基因中六核苷酸重复的扩增。为了系统解析ALS的分子图景，研究人员对携带病理性C9orf72重复扩增（ALS
神经退行性疾病（包括肌萎缩侧索硬化症（ALS））在很大程度上仍未解决，其复杂的病因尚未完全阐明。家族性和散发性ALS病例中最常见的遗传原因是C9orf72基因中六核苷酸重复的扩增。为了系统解析ALS的分子图景，研究人员对携带病理性C9orf72重复扩增（ALS-C9）和不携带该突变（ALS-non-C9）的ALS患者多个中枢神经系统区域进行了整合转录组学分析。同时，研究人员进行了全转录组细胞类型解卷积，以评估神经元和非神经元群体的细胞组成。研究人员鉴定了一组在ALS-C9和ALS-non-C9患者中一致失调的分子通路，提示共享的致病机制。不同的基因特异性改变也指向了分歧的亚型依赖性分子轨迹。基因特异性改变还与ALS-non-C9中的短临床病程相关，强调了性别依赖性免疫对疾病结局的贡献。跨区域整合转录组学分析揭示了ALS-C9和ALS-non-C9亚组之间汇聚和分歧的分子及细胞特征，强调了ALS的临床异质性，并为亚型和性别特异性治疗分层提供了框架。
**论文解读**
**研究背景、存在问题及研究目的**
肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS）是一种致命的神经退行性疾病，其特征是大脑和脊髓中运动神经元的进行性丧失，导致肌肉无力、瘫痪，最终呼吸衰竭。ALS的病因复杂，约40%的家族性ALS和7%的散发性ALS病例由C9orf72基因中的GGGGCC六核苷酸重复扩增（Hexanucleotide Repeat Expansion, HRE）引起。尽管C9orf72 HRE是ALS最常见的遗传病因，但该突变携带者（ALS-C9）与非携带者（ALS-non-C9）之间的分子差异，尤其在不同脑区和脊髓区域的分子差异，尚未完全阐明。此外，ALS在发病率和疾病进展上存在显著的性别差异，但其背后的分子机制尚不清楚。本研究旨在通过跨多个中枢神经系统（Central Nervous System, CNS）区域的整合转录组学分析，系统揭示ALS-C9与ALS-non-C9亚组之间共享与分歧的分子和细胞特征，并探讨性别和遗传背景如何共同塑造疾病异质性与临床病程。
**研究内容、结论与意义**
研究人员对来自316名受试者（77名对照和239名ALS患者，其中43名ALS-C9，196名ALS-non-C9）的10个CNS区域（小脑、颈髓、胸髓、腰髓、外侧运动皮层、内侧运动皮层、额叶皮层、海马、枕叶皮层、颞叶皮层）进行了转录组测序和细胞类型解卷积分析。研究发现ALS-C9与ALS-non-C9患者共享核心致病通路（如蛋白质稳态、细胞周期和DNA修复紊乱），但也存在亚型特异性分子轨迹。值得注意的是，在病程分析中，广泛激活的免疫、炎症和代谢通路在短病程的ALS-C9与ALS-non-C9患者中呈现出完全相反的调控方向。此外，研究在ALS-non-C9患者中鉴定出颈髓小胶质细胞扩增与短病程相关，且此关联在女性患者中更为显著，其中APOC2基因被确定为与小胶质细胞和性别差异密切相关的关键候选基因。该研究揭示了ALS的临床和分子异质性，强调了遗传背景和性别作为重要生物学变量在疾病机制和治疗策略中的关键作用。论文发表在《PLOS Genetics》。
**主要关键技术方法**
研究人员利用来自纽约基因组中心（New York Genome Center, NYGC）ALS联盟的1146个RNA-seq图谱（包括316例死后样本）。主要技术方法包括：使用DESeq2进行差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）分析；利用FGSEA和clusterProfiler进行基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）和过代表分析（Over-Represented Analysis, ORA）；采用CIBERSORTx基于人脑皮层单细胞RNA测序（scRNA-seq）参考数据集进行细胞类型解卷积；使用加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA）构建共表达网络。还运用了Kaplan-Meier生存曲线和Cox比例风险回归模型进行生存分析，以及敏感性分析和性别-诊断交互作用分析以排除性别失衡的混杂影响。
**研究结果**
**1. 非C9orf72型ALS中的性别依赖性生存趋势**
通过分析316名受试者的生存数据，研究人员发现男性患者整体生存期略长于女性（HR=0.73, p=0.0354）。在ALS-non-C9亚组中，男性患者的生存期显著长于女性（HR=0.70, p=0.0442），而ALS-C9亚组中未见显著性别差异。
**2. ALS-C9和ALS-non-C9中共同与分歧的转录组变化**
转录组分析显示，ALS-non-C9患者较ALS-C9患者有更多DEGs。共享DEGs在统计显著性上强于亚型特异性DEGs，且主要富集于蛋白质分泌、未折叠蛋白反应、PI3K-AKT-mTOR信号等通路，提示这些是ALS的核心致病程序。ALS-C9特异性DEGs比例较低（8–21%），表明其转录组变化大部分与ALS-non-C9共享。通过自举法（bootstrap）验证，DEG数量差异并非主要由样本量差异导致。
**3. C9和non-C9特异性基因对ALS不同致病机制的贡献**
基于每组织最显著的20个亚型特异性DEGs进行聚类分析，发现ALS-C9表现出高度特异性和碎片化的区域表达模式，而ALS-non-C9则显示更自然的解剖学聚类（脊髓区域紧密聚集）。过代表分析（ORA）显示，ALS-C9特异性基因富集于脂质稳态、免疫调节和胶原代谢通路（如Toll样受体结合、MHC II类抗原呈递）；ALS-non-C9特异性基因则富集于蛋白质合成（如细胞质翻译、核糖体组装）通路，并与阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病通路重叠。ALS-non-C9表现出更高的跨组织DEG重叠性，提示其具有系统性转录组改变。
**4. ALS-C9和ALS-non-C9在临床病程分组中的分歧性通路方向性**
将患者按病程四分位数分为短病程（≤2年）和长病程（≥4年）组进行GSEA分析。在ALS-C9中，短病程患者较之长病程患者表现出增殖、代谢和免疫相关通路（如MYC靶点、氧化磷酸化、mTORC1信号、干扰素反应）的广泛上调。相反，在ALS-non-C9中，短病程患者相对于长病程患者，上述相同通路却表现出广泛下调。这种对立的方向性在颈髓、外侧运动皮层、额叶皮层等多个区域一致重现，表明两种遗传亚型中与快速疾病进程相关的分子特征是基本相反的。
**5. APOC2与小胶质细胞正相关并在女性中上调，可能促进非C9型ALS患者较短的病程**
细胞类型解卷积分析显示，在ALS-non-C9短病程患者中，颈髓和胸髓的小胶质细胞分数显著增高，且女性患者颈髓小胶质细胞水平显著高于男性。在9个与病程相关的DEGs中，APOC2与小胶质细胞分数相关性最强，且是在ALS-non-C9女性患者中唯一显著上调的基因。APOC2表达与小胶质细胞标志物（TMEM119、CD11b、CD68、Iba1、HLA-DRA、HLA-DRB1、CD45）呈正相关。APOC2共表达基因（412个）的通路富集分析显示其主要参与免疫和炎症反应（如白细胞介导免疫、先天免疫应答、活性氧信号）。
**总结讨论与结论**
讨论部分指出，本研究揭示了遗传背景和性别如何交织塑造ALS的分子结构和病程相关的转录动态。共享通路（如蛋白质分泌、未折叠蛋白反应、mTORC1信号）强调了蛋白质稳态破坏是ALS的汇聚致病轴；而C9orf72突变特异的胆固醇稳态和TLR信号富集，以及非C9突变特异的蛋白质合成下调，表明亚型特异性机制。研究还发现，短病程ALS-C9中代谢和免疫通路上调，而短病程ALS-non-C9中这些通路下调，提示不同的致病动力学。小胶质细胞激活，尤其在女性ALS-non-C9患者中的增强，可能通过神经炎症影响生存期，且可能与绝经后雌激素丧失有关。结论部分（Conclusion）翻译如下：总之，ALS患者共享核心致病通路，特别是与蛋白质稳态、细胞反应和代谢调节相关的通路，但在这两种遗传亚型之间也观察到不同的分子特征和分歧的进展动态。ALS-C9的特征是短病程组较之长病程组中免疫和应激相关通路的激活更为显著。相反，ALS-non-C9患者表现出独特的调控模式，其中短病程病例中代谢和生物合成通路的富集低于长病程个体，这可能反映了ALS-non-C9背后的多种遗传和环境病因。小胶质细胞激活成为疾病进展的潜在调节因子，尤其在ALS-non-C9患者中，性别特异性影响提示绝经后雌激素的丧失可能加剧小胶质细胞驱动的神经炎症并恶化女性患者的预后。C9orf72重复扩增是ALS和额颞叶痴呆（FTD）最常见的病因，这一事实强调了桥接运动和认知神经退行性变的共享分子连续体。研究结果强调，遗传背景、胶质细胞-神经元相互作用和性别生物学共同塑造了疾病异质性，这些原理很可能扩展到多种神经退行性疾病。
