综述：QCM技术在蛋白质-配体相互作用研究中的应用：挑战与解决方案

《Drug Discovery Today》：Protein–ligand interactions by QCM: challenges and resolutions

　　奥尔加·沃尔科娃|阿纳斯塔西娅·塞罗娃|叶卡捷琳娜·斯科尔布|叶夫根尼·斯米尔诺夫•QCM是一种高灵敏度的无标记技术，可用于实时分析蛋白质与小分子的相互作用，能够检测对药物发现至关重要的纳克级质量变化。•本综述详细介绍了将蛋白质固定在QCM传感器上的有效策略，并提供了准确测量小分子结合的关键挑战的解决方案。•文中还提供了规划QCM实验的实用指南和流程，同时附有汇总表，列出了蛋白质-配体研究中的关键实验数据。•这一综合框架将基础理论与实际应用相结合，展示了QCM在理性药物设计中计算结合常数以及制造用于医疗和食品安全诊断的稳健生物传感器方面的独特价值。

引言
了解自然水环境中的蛋白质-配体相互作用对于阐明生物过程、生化途径和信号网络至关重要。1为量化这些相互作用，研究人员依赖于关联/解离常数（Ka/Kd）、米氏常数（Km）以及半最大抑制浓度和/或有效浓度（IC50/EC50）等关键参数。最近的一篇综述2概述了根据具体目标，在药物发现中用于分析蛋白质-配体相互作用的几种实验技术。最常用的是：荧光偏振法（FP）、表面等离子体共振法（SPR）、生物层干涉仪法（BLI）和等温滴定量热法（ITC）。表1简要描述了这四种方法，包括工作原理、是否需要蛋白质修饰、样品制备、所需蛋白质量及其局限性。在这些技术中，石英晶体微天平（QCM）3已作为一种强大且具有吸引力的工具出现。它基于压电效应原理工作，即石英晶体谐振器会对表面的质量变化做出反应。QCM传感器的表面通常覆盖着一层薄薄的溅射金膜。QCM能够实时监测液体环境中的相互作用。其极高的质量灵敏度（低于10 ng/cm2）以及通过耗散监测（QCM-D）追踪结构粘弹性特性的能力，使其特别适合研究蛋白质与类药分子之间的相互作用。[4]，[5]

在理想的蛋白质-配体结合QCM实验中，先固定蛋白质层，然后再捕获配体，应会产生明显的负频率偏移，表明质量增加（图1a）。然而，研究人员常常遇到意外结果，如正频率偏移或根本没有偏移。这些异常可能源于各种挑战，包括不正确的蛋白质固定导致结合位点被遮盖（图1b,c）、蛋白质与传感器表面的附着力较弱（图1d）、仪器的固有灵敏度限制（图1e）或溶剂效应（图1f,g）。本综述旨在整合并呈现一个全面的理论与实践框架，利用QCM来表征类药配体与其靶蛋白的亲和力——这是理性药物设计的基石。它涵盖了基本的理论原则，并详细介绍了有效的蛋白质固定策略，这些策略对于开发用于医疗诊断和食品安全的稳健生物传感器也至关重要。除了理论部分，另一个核心目标是帮助研究人员克服常见的实验障碍（图2）。为此，本文提供了详细的故障排除部分，用于数据解读，同时还列有汇总表，记载经过验证的实验条件及针对常见问题的解决方案。虽然重点在于蛋白质-配体相互作用，但所介绍的方法也广泛适用于其他分子相互作用。通过提供最新的概览和前瞻性观点，本综述旨在推动更多研究，将QCM应用于具有重大意义的理论研究和实用设备开发。

章节节选
理论基础
QCM的主要原理基于其表面吸附的质量与共振频率变化之间的关系。振荡石英晶体上的质量增加（Δm）会导致共振频率下降（Δf），而质量减少则会导致频率上升。6这种关系可通过Sauerbrey方程（公式1）[3]，[7]进行定量描述：Δffref=-Δmmref，其中Δffref是由于质量吸附引起的频率偏移分数，fref是参考频率。

蛋白质在QCM传感器表面的吸附策略
将蛋白质固定在传感器表面是QCM分析中的关键步骤。任何破坏蛋白质空间结构的行为都可能导致其生物活性丧失，从而产生不准确的结果。蛋白质在传感器表面的固定通常被视为物理（非共价结合）或化学（共价结合）过程。根据具体任务以及蛋白质的结构和性质，可采用多种方法进行固定。

QCM数据解读的挑战
什么会导致正频率偏移？
前文已经讨论了由于非线性Δf-Δm依赖关系而产生的误差，以及通过粘弹性建模（公式6）进行修正的方法。由于公式6是基于一维波动方程推导的（所有量仅取决于z轴），因此它适用于横向均匀的薄膜——例如聚合物或蛋白质薄膜。7相比之下，那些本质上不均匀的颗粒的吸附——比如最初以球形附着随后破裂的脂质体16——则不适用该公式。

结论
本综述确立了QCM作为一种强大的分析平台，可用于实时、无标记地分析蛋白质-配体相互作用。通过系统阐述基本原理、固定策略和解读框架，我们展示了QCM在药物发现和生物传感应用中的巨大潜力。该方法能够在接近生理条件的环境下监测界面质量和结构变化，同时具备纳米级灵敏度和极低的样品需求。

CRediT作者贡献说明
奥尔加·沃尔科娃：写作——初稿撰写、可视化、正式分析、数据整理、概念构思。阿纳斯塔西娅·塞罗娃：写作——初稿撰写、可视化。叶卡捷琳娜·斯科尔布：写作——综述与编辑、监督、资金获取、概念构思。叶夫根尼·斯米尔诺夫：写作——综述与编辑、初稿撰写、可视化、监督、资源协调、项目管理、研究实施、正式分析、概念构思。

未引用参考文献
[84]，[88]。

利益冲突声明
不存在需要声明的利益冲突。

致谢
本研究是在俄罗斯联邦科学与高等教育部的一项国家任务支持下进行的（项目编号075-15-2024-483）。作者们感谢语言编辑工具（LanguagTool?）在优化手稿的语言表达和语法结构方面所提供的帮助。需要指出的是，这些工具仅用于语言润色。

奥尔加·沃尔科娃是ITMO大学信息化学科学中心化学控制与界面研究组的博士生。她的研究兴趣在于将石英晶体微天平等实验方法与分子对接和动态模拟等计算和化学生物信息学方法相结合，用于预测和验证蛋白质与类药小分子之间的相互作用。