基于多基因位点DNA条形码技术的Ardisia blatteri与Ardisia pauciflora物种鉴定及ITS2二级结构预测

《Gene Reports》：Multilocus DNA barcoding-assisted species identification and ITS2 secondary structure prediction of Ardisia blatteri and Ardisia pauciflora

　　马丁·希尔林·丹尼斯|穆鲁甘·吉塔|拉金德拉恩·K·塞尔瓦凯萨万|奇纳萨米·克里希纳维尼|威尔逊·阿里斯达桑|马里穆图·坎查纳印度泰米尔纳德邦科因巴托尔市皮拉梅杜的PSGR克里什南马尔女子学院，邮编641004摘要报春花科中，报春花属是最大的属，长期以来一直被用于传统医学。虽然某些报春花属植物具有独特特征，但它们的营养体特征往往相似，这使得使用传统分类法难以区分它们。DNA条形码技术通过利用短DNA片段来识别植物，现已成为区分物种的有效方法。在本研究中，我们使用了三个条形码区域：rbcL、matK和ITS2，对比了两种报春花属植物——阿布勒报春花和少花报春花。我们还分析了ITS2的二级结构在识别中的作用。我们的分析采用了BLASTn、系统发育树、热图聚类以及二级结构预测等方法。研究发现，仅使用一个条形码并采用邻接法进行区分的能力，不如使用多个条形码区域。matK与ITS2结合使用取得了最佳结果，通过邻接法分析的分辨率为87.5%。热图聚类也显示出了所研究的两种报春花属植物之间存在明显的遗传差异，并揭示了相关报春花属植物之间的遗传关系。我们生成的二级结构进一步有助于区分这些物种。本研究为阿布勒报春花和少花报春花建立了参考DNA条形码序列，从而为这些物种提供了初步的分子信息。此外，研究结果表明，结合核基因和质体标记可能提高这两种研究较少的报春花属植物的分辨率和识别精度。引言报春花属是报春花科中一个种类繁多的属，包含700种已确认的物种，主要分布于世界的热带和亚热带地区。一般来说，报春花属由于具有游离雄蕊和多列胚珠的特点，而与其他千屈菜亚目属区分开来（杨和胡，2022）。报春花属植物主要用作观赏植物，尤其是在中国，它们是结红色果实的灌木或小乔木。迄今为止，已有许多报春花属植物被发现具有药用价值，传统上被用来治疗腹泻、癌症、高血压和月经失调等疾病（张等人，2024；刘等人，2022）。在印度已报道的29种报春花属植物中，有两种研究较少的植物——阿布勒报春花和少花报春花尤其值得关注。阿布勒报春花是一种印度特有物种，被列为濒危物种，含有多种植物成分，常被用来治疗发热、咳嗽、风湿病和炎症（国际自然保护联盟，2016）（亚达夫和卡鲁普萨米，2025；罗伊等人，2017）。少花报春花是印度和斯里兰卡的特有植物，在保护状况评估中被归类为“未评估”（拉奥等人，2019a；拉奥等人，2019b）。尽管报春花属植物因其药用价值而被利用，但由于趋同进化以及种内形态变异较大等原因，使得某些报春花属植物的植物材料难以准确鉴定（熊等人，2022）。例如，椭圆报春花这一物种常常被误认为是低矮报春花和茄叶报春花，因为这三种植物具有相似的营养体特征，很难仅凭形态学特征加以区分（杰克斯，2009）。同样，锯齿报春花复合群中的各个物种也具有重叠的分子特征（俊和年何，2012），从而导致误鉴。由于报春花属植物名称的混淆以及形态学特征的相似性，往往会导致分类鉴定出现误差（张等人，2024；刘等人，2013）。除了分类上的混乱之外，近年来人们还对报春花属植物产品的质量和安全性表示担忧（刘等人，2013）。特别是市场调查显示，价格低廉的柔枝杜鹃的根和圆叶千里光的茎被用作商业化巨叶报春花产品中的主要掺假物（赵等人，2021；戴等人，2018）。报春花属植物产品中日益严重的掺假和误鉴问题，凸显出需要一种可靠的物种鉴定方法。尽管过去人们采用了多种传统的形态学、显微镜学及其他特征鉴定方法，但该属内的分类不确定性仍然普遍存在，这进一步强调了需要依靠分子方法来进行准确的物种鉴定（小林和德梅希亚，2005；熊等人，2022）。为了解决这一问题，加拿大圭尔夫大学生物多样性基因组学中心开发的DNA条形码技术等分子生物学领域的最新进展，使得识别和验证报春花属植物成为可能。DNA条形码技术无需专业的分类学知识，即可识别物种，且不受生理条件或样本形态的影响。它基于使用一段短而标准的区域，从而实现经济高效的物种识别。DNA条形码最显著的优势在于其通用性、对变异的特异性以及应用的便捷性（康等人，2017）。过去几十年来，人们已经发现了多个可用于区分植物物种的候选区域，如rbcL、trnL-F、psbA-trnH、matK、ITS、18S-rRNA和5S-rRNA等。在用于被子植物、苔藓植物、石松植物、裸子植物和单子叶植物鉴定的质体和核基因位点中，rbcL、matK和ITS这三个位点被更频繁地使用（刘等人，2019）。由于这些叶绿体基因位点具有高度的通用性、易于扩增以及适用于各种被子植物和药用植物，因此被认定为陆生植物的核心条形码（CBOL植物工作组，2009）。此外，它们的保守区域和高拷贝数有利于扩增和测序，使其成为系统发育分析的重要工具（于等人，2021）。而ITS区域则由于具有较高的序列变异率以及独特的条形码间隙，因此在识别亲缘关系密切的药用植物方面具有更强的鉴别能力（陈等人，无日期；巴多蒂等人，2017）。鉴于这些标记在扩增效率和通用性方面的互补优势，本研究选择了rbcL、matK和ITS的组合，以提高物种区分度并解决报春花属植物之间的分类混淆问题。正如一些研究所示，还可以采用多基因位点的组合策略，将不同的编码和非编码质体区域以及核核糖体间隔区结合使用（米什拉等人，2017）。此外，多基因位点DNA条形码技术现已被认可为识别传统药用植物的有效方法（朱等人，2022）。而且，利用DNA条形码序列进行的系统发育分析，已成为识别物种及了解不同类群之间进化关系的强大工具。这种方法借助线粒体和叶绿体基因等特定的遗传标记，构建系统发育树，从而阐明物种的多样性和亲缘关系（阿卜杜萨拉姆等人，2022）。本研究的主要目的是在分子水平上识别两种研究较少的报春花属植物，重点关注rbcL、matK和ITS2这三个区域。DNA条形码技术有助于推动基于证据的草药医学发展，促进生物多样性保护，同时也有利于可持续利用报春花属植物。尽管熊等人（2022）已经评估了这些DNA条形码位点在多种中国报春花属植物中的鉴别能力，但本研究在诸多方面对以往的研究进行了拓展。首先，通过研究两种研究较少的物种来生成新的DNA条形码序列；其次，利用报春花属中不同的近缘物种进行系统发育分析。此外，ITS2的二级结构分析也为物种鉴别提供了补充证据。多项研究表明，预测RNA二级结构是一种先进的物种区分方法，将二级结构数据纳入物种鉴定过程中，能够显著提高对不同植物物种鉴定的精确度（刘等人，2019；赛顿等人，2023）。然而，关于如何利用ITS2的二级结构预测结果来区分不同物种的报道还相对较少。植物采集与鉴定阿布勒报春花的植物材料（凭证编号：163689（MH））采集自泰尼县的梅加马拉伊地区，而少花报春花的植物材料（凭证编号：163503（MH））则采集自泰米尔纳德邦的蒂鲁内尔维利地区。这些植物样本被装在含有硅胶的塑料袋中，剪下后储存在-20℃环境下，以便后续提取。所采集的植物材料如图1所示。这些植物是由印度植物调查局南方区域中心的科学家E阿里斯达桑博士进行鉴定的。PCR扩增、序列特征及变异分析在本研究中，三个候选的植物条形码位点——rbcL、matK和ITS2的PCR扩增率均为100%。不过，各条带的强度存在差异，其中rbcL产生的条带清晰且强度较高，而matK和ITS2产生的条带强度则相对较低，具体如图2所示。在这三个位点中，rbcL的扩增效果最好且最为完整，因此它是本研究中用于物种鉴定的最可靠标记。rbcL的出色表现尤其……讨论DNA条形码技术可以通过靶向一段保守的DNA片段来实现物种鉴定（李等人，2021；牛等人，2024）。一个有效的条形码应易于扩增、测序和解析，同时具备较高的物种区分和鉴定能力（拉尼等人，2026）。在本研究中，我们使用了两种植物样本以及报春花属中的相关物种，测试了三个DNA区域（rbcL、matK和ITS2）。rbcL片段易于扩增和测序，此前……结论本研究阐述了rbcL、matK和ITS2这三个DNA条形码基因在区分两种报春花属植物及其近缘物种方面的有效性，同时还结合了二级结构预测结果。通过运用多基因位点DNA条形码技术、系统发育推断和聚类分析，我们确认阿布勒报春花和少花报春花这两个谱系在遗传上具有统一性，同时在进化方面也存在差异，它们明显区别于其他报春花属植物。通过对核基因、质体基因……致谢作者们还要感谢印度泰米尔纳德邦科因巴托尔市皮拉梅杜的PSGR克里什南马尔女子学院植物学系，感谢他们为这项研究提供了所需的资源和设施。