PTEN拮抗肽（PTEN Antagonistic Peptides, PAPs）在神经元生长与创伤性脑损伤（Traumatic Brain Injury, TBI）中的作用分析

《Biomacromolecules》：Analysis of PTEN Antagonistic Peptides (PAPs) in Neuronal Growth and Traumatic Brain Injury (TBI)

　　

PTEN（磷酸酶与张力蛋白同源物，phosphatase and tensin homologue）是公认的细胞内生长抑制因子，其抑制可促进啮齿动物模型中受损神经元的再生。本研究采用基于肽的PTEN抑制策略，靶向PTEN的磷酸酶活性。为此，研究人员将PAP2（PTEN antagonistic peptide 2）与TAT（转录反式激活因子，transactivator of transcription）融合形成融合肽PAP2-TAT，以实现细胞摄取。PAP2-TAT无细胞毒性，可进入原代小鼠神经元胞质，增强神经元突起（neurite）生长、生长锥（growth cone）面积及突触素（synaptophysin）丰度。PAP2-TAT轻微上调P-AKT（磷酸化蛋白激酶B，phosphorylated AKT serine/threonine kinase），更显著地上调P-ERK（磷酸化细胞外信号调节激酶，phosphorylated extracellular signal?regulated kinase）水平。此外，给予PAP2-TAT后信号转导与转录激活因子（signal transducer and activator of transcription, STATs）发生磷酸化。迄今PAPs尚未应用于创伤性脑损伤（traumatic brain injury, TBI）研究。在小鼠TBI模型中，单次注射PAP2-TAT改善了部分步态（gait）障碍参数，但对神经炎症及TBI相关的体重减轻无影响。综上，基于肽的PTEN抑制有助于脑损伤后神经元生长与再生。

论文解读：PTEN拮抗肽（PAP2-TAT）促进神经元生长及其在小鼠创伤性脑损伤模型中的初步评价

本文发表于《Biomacromolecules》，研究背景如下：PTEN（phosphatase and tensin homologue，磷酸酶与张力蛋白同源物）是具有脂质与蛋白质双重磷酸酶活性的抑癌蛋白，通过拮抗PI3K（phosphoinositide 3?kinase，磷脂酰肌醇3?激酶）信号通路充当细胞生长"刹车"。基因水平敲除PTEN可促进神经元胞体肥大、树突分支增多、轴突再生及突触形成，在脊髓损伤和创伤性脑损伤（traumatic brain injury, TBI）模型中显示出促再生潜力。然而全身性基因敲除或小分子化合物（如bpV）抑制PTEN存在脱靶效应及肿瘤风险。此前已有研究报道PTEN拮抗肽（PTEN antagonistic peptides, PAPs）可靶向PTEN磷酸酶结构域并偶联TAT（transactivator of transcription，HIV?1转录反式激活因子）穿膜序列实现胞内递送，在脊髓损伤模型中促进皮质脊髓束侧枝发芽和功能恢复，但PAPs尚未在TBI模型中检验。鉴于TBI造成机械性神经元连接断裂，研究人员假设PAP2介导的PTEN磷酸酶抑制可增强神经元生长与损伤后再生，因而在体外原代神经元及小鼠闭合性颅脑撞击（weight?drop）TBI模型中系统评估PAP2?TAT融合肽的生物学效应。

主要关键技术方法：

研究人员采用Fmoc固相多肽合成法（solid?phase peptide synthesis, SPPS）合成PAP2、TAT及PAP2?TAT（含FITC荧光标记变体），经制备型反相高效液相色谱（reverse?phase HPLC）纯化及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI?TOF MS）鉴定。使用人神经母细胞瘤SH?SY5Y细胞及原代小鼠海马神经元（C57BL/6J新生鼠P0–P2）进行细胞活力（CellTiter?Glo发光法）与细胞摄取（共聚焦荧光显微镜定量）检测。原代神经元经3 μM肽处理24 h后，通过免疫荧光染色（βIII?tubulin、MAP2、phalloidin、synaptophysin）分析神经元突起长度、分支数、生长锥面积及突触前标记点密度。Western blot检测P?AKT(Ser473)、总AKT、P?ERK1/2、总ERK1/2；磷酸化抗体芯片（phospho?antibody array, 304个位点）筛选下游信号变化并经P?STAT5A/B免疫细胞荧光验证。体内实验采用C57BL/6J小鼠闭合性weight?drop TBI模型，伤后立即于撞击灶局部注射PAP2?TAT（10 μM，2 μL）或对照，通过CatWalk XT步态分析系统于伤前及伤后1、3、5、7天评估步态参数，终点取脑行石蜡切片GFAP（胶质纤维酸性蛋白，glial fibrillary acidic protein）、Iba1（离子钙结合适配分子1，ionized calcium?binding adapter molecule 1）免疫组化及损伤区面积测量。分组随机化且操作者盲法评估。

研究结果

Synthesis and Characterization of Peptides（肽的合成与表征）

研究人员通过Fmoc?SPPS合成PAP2（KHKNHYKIYNLCAE）、TAT（RKKRRQRRR）及二者融合肽PAP2?TAT，FITC标记时引入Ahx间隔臂。分析型HPLC显示各肽纯度>95%，MALDI?TOF MS测得分子量符合理论值（PAP2?TAT M_w=3081.7 Da）。含TAT的肽因极性较强在C18柱上保留时间较早，FITC标记肽因疏水性染料保留时间延后，证实成功合成目标融合肽。

PAP2?TAT Does Not Impair Cell Viability and Is Taken Up by Different Cell Types（PAP2?TAT无细胞毒性且被高效摄取）

用FITC?PAP2（无TAT）与FITC?PAP2?TAT分别处理SH?SY5Y细胞，前者无绿色荧光表明不能入胞，后者约90%细胞呈胞质荧光且定位于细胞质。CellTiter?Glo检测显示0.1–10 μM PAP2?TAT对SH?SY5Y无显著毒性，>10 μM出现细胞活力下降。原代小鼠海马神经元及皮层器官型切片中同样观察到FITC?PAP2?TAT约90%神经元阳性摄取，而FITC?PAP2不能进入细胞，证实TAT融合是实现PAP2胞内递送的必要手段且在原代神经元中高效。

PAP2?TAT Stimulates Primary Neuronal Growth and Enhances Growth Cone Size and Presynaptic Marker Abundance（PAP2?TAT促进原代神经元生长、增大生长锥面积并增加突触前标记丰度）

在未包被（生长限制）玻片上培养原代海马神经元，加3 μM PAP2?TAT使有大突起神经元比例、平均突起长度及每神经元分支数与PLL/层粘连素（poly?L?lysine/laminin, PLL/lam）正对照组相当，显著优于空白、DMSO、单独PAP2或单独TAT处理。Phalloidin标记的丝状肌动蛋白（F?actin）显示PAP2?TAT处理组生长锥面积约为对照组的2倍。Synaptophysin（突触素，突触前囊泡膜蛋白）免疫荧光点密度在PAP2?TAT组显著高于各对照组，提示PTEN抑制促进早期突触前结构形成。单独TAT轻微增加分支和生长锥面积但不影响synaptophysin点密度，说明PAP2介导的PTEN抑制是主要促生长效应来源。

PAP2?Mediated PTEN Inhibition Upregulates MAP Kinase and STAT Signaling（PAP2介导的PTEN抑制上调MAP激酶与STAT信号）

原代神经元经1、3、10 μM PAP2?TAT处理30 min，Western blot显示P?AKT/AKT比值仅轻度波动，而P?ERK1/2/总ERK比值在1 μM和3 μM时显著升高，单独TAT无此效应。磷酸化抗体芯片筛查发现P?STAT5B与P?STAT2上调最显著，P?BLNK下调。免疫细胞荧光确认PAP2?TAT（非单独PAP2或TAT）提高核内P?STAT5A/B（磷酸化信号转导与转录激活因子5A/B）核质比，表明PTEN抑制除微弱影响PI3K/AKT外，还激活MAPK/ERK与JAK/STAT通路。

PTEN Inhibition by PAP2?TAT Modulates and Improves Selected TBI?Affected Parameters（PAP2?TAT介导的PTEN抑制改善部分TBI影响的步态参数）

C57BL/6J小鼠接受weight?drop闭合性TBI后即刻局部注射PAP2?TAT、单独PAP2、单独TAT或DMSO，假手术组仅开颅不撞击。所有组术后短期体重下降无组间差异。CatWalk XT分析示：TBI降低后肢站立时间（stand time），各组无差异；Duty cycle（站立时/步周期）在DMSO、PAP2、TAT组TBI后降低，PAP2?TAT组值与假手术相当；Stride length（步幅）TBI后在DMSO/PAP2/TAT组增大（异常代偿），PAP2?TAT组接近假手术基线；Hind paw print width（后爪印宽）TBI后在DMSO和PAP2组缩小，PAP2?TAT及TAT组维持近基线。组织学示TBI后皮层GFAP⁺星形胶质细胞与Iba1⁺小胶质细胞活化面积在各肽处理与DMSO间无差异，即PAP2?TAT未改变急性神经炎症反应；损伤腔面积PAP2?TAT组略小于DMSO但未达显著性。表明单次局部PAP2?TAT可部分纠正TBI引起的特定运动步态异常，但对神经炎症与体重无影响。

讨论与结论总结（翻译）：

本研究中，研究人员进一步验证了基于肽的PTEN抑制用于神经损伤治疗的可行性。在多种神经元细胞类型中，PAP2?TAT满足低细胞毒性（≤10 μM）和高胞内摄取率两个条件——即便TAT序列较既往文献缩短4个氨基酸仍实现高效递送。先前已报道靶向PTEN磷酸酶结构域的PAP2及靶向C端结构域的PAP4可促进外周与中枢神经元生长，本研究证明PAP2同样刺激中枢（海马）神经元生长、增大生长锥并增加树突上synaptophysin斑点，与PTEN基因缺失表型一致。生长锥增大可能与PTEN解除对微管动力学的抑制有关。信号层面，P?AKT仅轻微上调，而P?ERK明显升高——与脊髓损伤中PAP效果一致——提示MAPK/ERK参与PTEN抑制后的再生反应；磷酸化芯片新发现STAT（尤其是STAT5B/2）及CaMKII（Thr287自磷酸化）激活，暗示PTEN阻断可能通过多重通路调控生长锥与再生。在TBI模型中，局部单次PAP2?TAT注射改善部分受损步态参数（duty cycle趋近假手术、print width维持），损伤区有缩小趋势，但对神经胶质活化及体重无作用；效应弱于脊髓损伤中全身多次给药的研究，可能受限于TBI个体变异大、局部单次于给药剂量/持续时间不足，未来需探索持续脑内输注等方式。需注意TAT本身具轻微生物活性（分支、生长锥面积微增），实验中须设TAT单独对照。磷酸化芯片因需大量组织合并故n=1，经ICC独立验证P?STAT5。综上，PAP2?TAT通过肽介导的PTEN磷酸酶抑制增强神经元生长、生长锥尺寸及突触前标记，支持其在CNS损伤后促再生中的应用潜力；在小鼠TBI模型中单次局部给药可轻微调节特定步态缺损，提示PAPs是TBI后促神经再生的有前景的工具分子，值得进一步在体药效学优化研究。