小鼠嗅球星形胶质细胞中去甲肾上腺素能Ca2+与cAMP信号的通话（Crosstalk）

《Cell Communication and Signaling》：Crosstalk of noradrenergic Ca2+ and cAMP signaling in astrocytes of the murine olfactory bulb

　　

环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate, cAMP）与Ca2+是普遍存在的第二信使，调控基因表达、代谢及突触可塑性。研究人员在小鼠嗅球（olfactory bulb, OB）星形胶质细胞中识别出Ca2+与cAMP信号通路间复杂的相互作用。去甲肾上腺素（norepinephrine, NE）通过α1与α2肾上腺素受体升高Ca2+与cAMP水平，而β受体仅触发cAMP响应。α1受体激动剂去氧肾上腺素（phenylephrine）增加cAMP，但当通过Ca2+耗竭及移除胞外Ca2+阻断Ca2+升高时，该效应被抑制。研究人员发现α1A与α1D受体是去氧肾上腺素的关键靶点，作用于α1受体激活下游的Ca2+/钙调蛋白依赖性腺苷酸环化酶（adenylyl cyclases, AC）AC1与AC3。此外，α2受体刺激升高Ca2+水平从而刺激cAMP产生，但也降低毛喉素（forskolin）诱导的cAMP升高，表明α2受体既可通过Gi抑制腺苷酸环化酶，也可通过Ca2+信号刺激AC1/AC3。综上所述，这些发现揭示了所有三种肾上腺素受体亚型介导的小鼠嗅球星形胶质细胞中去甲肾上腺素能Ca2+与cAMP信号间错综复杂的通话（crosstalk）。

该研究发表于《Cell Communication and Signaling》。研究背景方面，蓝斑（locus coeruleus, LC）是脑内去甲肾上腺素（norepinephrine, NE）的主要来源，约40%的LC神经元投射至嗅觉处理的初级中枢嗅球（olfactory bulb, OB），这一投射量十倍于皮层其他区域。NE及其对OB神经动力学的影响对于稳定且特异的嗅觉记忆形成至关重要，并在帕金森病早期嗅觉功能障碍及星形胶质细胞（astrocytes）功能异常相关的神经疾病中发挥关键作用。肾上腺素受体分为α与β受体，α受体进一步分为α₁（偶联G_q，刺激PLC/IP₃依赖的内质网Ca²⁺释放）与α₂受体（偶联G_i，抑制腺苷酸环化酶（adenylyl cyclases, AC）），β受体偶联G_s导致AC刺激。尽管OB受LC密集支配，且星形胶质细胞中cAMP信号参与葡萄糖代谢、血流调节、胞吐、突触可塑性及警觉与记忆形成等行为，但OB星形胶质细胞中的去甲肾上腺素能cAMP信号仍未被充分探索，且Ca²⁺与cAMP在单细胞水平的相互作用缺乏直接证据，特别是Ca²⁺依赖性AC（如AC1、AC3、AC8）在星形胶质细胞中的整合作用尚不明晰。

为此，研究人员在小鼠OB星形胶质细胞中探究NE诱导的cAMP与Ca²⁺信号，旨在阐明三种肾上腺素受体亚型如何通过对AC的不同调控机制介导这两类第二信使间的通话（crosstalk），明确其依赖与不依赖于Ca²⁺的具体通路及受体亚型特异性。

为开展研究，研究人员主要采用以下关键技术方法：使用C57Bl/6J野生型小鼠及GLAST-CreERT2 x GCaMP6s^fl/wt小鼠，通过眶后窦注射携带星形胶质细胞特异性gfaABC1D启动子驱动的基因编码cAMP传感器Flamindo2及红色荧光Ca²⁺指示器jRCaMP1a的腺相关病毒（AAV^2/PhP.eB及AAV^2/PhP.AX）实现OB星形胶质细胞的双色表达；制备220 μm OB矢状脑片进行共聚焦成像；利用药理学手段应用亚型特异性肾上腺素受体激动剂（去氧肾上腺素phenylephrine、异丙肾上腺素isoprenaline、赛拉嗪xylazine）与拮抗剂（哌唑嗪prazosin、育亨宾rauwolscine、ICI 118,551、RS100329、BMY7378）及AC抑制剂（ST 034307、NKY80）、Ca²⁺操控药物（环吡唑酮cyclopiazonic acid, CPA、零钙人工脑脊液）干预信号通路；结合免疫组化（抗GFAP、抗S100B、抗GFP）验证表达特异性，并通过同时成像分析NE诱导的荧光变化以量化Ca²⁺与cAMP动态。

研究结果如下：

Norepinephrine evokes cAMP signals in astrocytes of the olfactory bulb：研究人员利用Flamindo2确认其在OB星形胶质细胞中特异性表达于GFAP与S100B阳性细胞，NE以剂量依赖性方式诱导cAMP升高，EC₅₀为1.72 ± 0.19 μM，选用10 μM NE诱导最大响应，且确认信号源于cAMP浓度变化而非pH改变。

NE-induced cAMP signals are independent of neuronal activity and mediated via α₁, α₂, and β adrenergic receptors：在TTX及谷氨酸/GABA受体阻断剂存在下，NE仍能直接诱导星形胶质细胞cAMP升高，表明其不依赖神经元活动。亚型特异性拮抗剂（哌唑嗪、育亨宾、ICI 118,551）分别显著抑制响应，三联阻断完全消除信号，证实α₁、α₂、β受体均参与。激动剂实验显示异丙肾上腺素（β）诱导最大cAMP响应，去氧肾上腺素（α₁）与赛拉嗪（α₂）亦能升高cAMP，但赛拉嗪在毛喉素预刺激时可降低cAMP，揭示α₂受体兼具G_i抑制与Ca²⁺依赖性刺激的双向调控。

NE-induced cAMP signals partly depend on Ca²⁺signals：同步双光子成像显示，去除胞外Ca²⁺或耗竭内质网Ca²⁺储存（CPA）均部分抑制NE诱导的cAMP升高，二者联合虽完全消除Ca²⁺信号，但仍残留约22%的cAMP信号，表明NE诱导的cAMP包含Ca²⁺依赖（α₁/α₂介导）与Ca²⁺非依赖（β/G_s介导）两部分。异丙肾上腺素诱导的cAMP不受CPA影响，验证了β通路的Ca²⁺非依赖性。

PE-induced cAMP signals are Ca²⁺-dependent：去氧肾上腺素（PE）诱导的cAMP呈剂量依赖性（EC₅₀1.26 ± 0.33 μM），该信号在CPA或零钙液中显著抑制，二者联合或阻断IP₃受体（2-APB+HC-067047）则完全消除，证明α₁受体介导的cAMP完全依赖PLC/IP₃通路引发的ER Ca²⁺释放及后续Store-operated Ca²⁺entry（SOCE）。

The α_1Aand α_1Dreceptor subtypes increase Ca²⁺and cAMP：亚型拮抗剂实验显示，α_1A拮抗剂RS100329完全阻断88%细胞的PE诱导Ca²⁺与75%细胞的cAMP信号，α_1D拮抗剂BMY7378完全阻断14%细胞的Ca²⁺与70%细胞的cAMP信号并减弱其余响应，二者联用完全抑制，表明α_1A与α_1D共同介导信号且α_1B无显著作用；此外PE诱导Ca²⁺响应细胞比例（95%）高于cAMP响应（53%），提示仅部分表达α₁受体的星形胶质细胞耦合至Ca²⁺依赖性AC激活。

Ca²⁺-induced cAMP signals are mediated by AC1 and AC3：AC1特异性抑制剂ST 034307完全阻断69%细胞的PE-cAMP信号，AC3倾向性抑制剂NKY80完全阻断59%细胞信号，二者联用完全消除PE响应，表明Ca²⁺依赖性cAMP主要由AC1与AC3（Ca²⁺/calmodulin-stimulated ACs）介导，而非可溶性AC10或其他非Ca²⁺敏感性AC。

讨论部分总结：研究人员在讨论中指出，NE通过所有三类受体（α₁、α₂、β）诱导OB星形胶质细胞cAMP生成，其中β受体经经典G_s通路独立诱导全部细胞响应，α₁与α₂则在亚群细胞中经Ca²⁺升高激活AC1/AC3。α₂受体呈现双向调控：静息状态下Ca²⁺依赖性刺激占优致cAMP上升，而当AC被毛喉素预激活时G_i抑制占优致cAMP下降。PE诱导的cAMP完全依赖Ca²⁺，需内质网释放与SOCE协同，且α_1A与α_1D在Ca²⁺与cAMP耦合中存在异质性，α_1D主要增强α_1A引发的Ca²⁺幅度以达AC激活阈值。AC1与AC3被确定为关键效应器，排除了AC10主要贡献。结论部分表明，NE激活的星形胶质细胞cAMP生成经由受体特异性与Ca²⁺依赖/非依赖通路协同作用以充分激活AC，这种复杂整合优化了神经元性能所需的代谢互作与突触可塑性。