用于选择性合成25-羟基维生素D2和D3的真菌过氧化酶的全面评估

《Biotechnology for Biofuels and Bioproducts》：Comprehensive assessment of fungal peroxygenases for the selective synthesis of 25-hydroxyvitamins D2 and D3

　　

摘要

背景

在多种疾病的治疗及食品补充方面，代谢物25-羟基维生素D相较于维生素D（钙化醇）本身具有更优异的效果。本研究报道了一种高效的生物技术方法，能够以一步反应的方式，从易获取且价格相对低廉的维生素D₂（来自真菌和酵母）以及维生素D₃（来自动物）出发，合成25-羟基维生素D₂和25-羟基维生素D₃。

结果

为实现维生素D（D₂和D₃）的C25位选择性羟基化，研究人员对多达71种非特异性过氧化酶进行了广泛研究，这些过氧化酶来自41种真菌物种，其同工酶及变体均表达在Komagataella phaffii（原名Pichia pastoris）中。初步实验表明，有42种过氧化酶能够将维生素D₂转化为相应的25-羟基衍生物，转化率范围很广（从5%到超过99%），且大多数情况下都具有较高的区域选择性，这一结果是通过GC–MS检测确定的。其中转化率和区域选择性最佳的16种过氧化酶被用于维生素D₃的羟基化反应。在使用维生素D₃时，除了25-羟基衍生物外，其他羟基化衍生物也会被生成，唯一的例外是来自Hypoxylon属的过氧化酶（HspUPO）。最终，研究人员利用HspUPO，并结合不同的辅底物，如H₂O₂或O₂/还原剂，以及抗坏血酸、没食子酸或焦性没食子酸作为还原剂，实现了25-羟基维生素D₂和D₃的大规模合成，最大底物浓度可达20 mM。所有辅底物都能带来较高的转化率（维生素D₂为68–97%，维生素D₃为63–75%），产物产率分别为（维生素D₂为14–19 mM，维生素D₃为13–15 mM），其中焦性没食子酸/O₂和H₂O₂在两种维生素的合成中表现最佳。

结论

这种方法为这类羟基化化合物的化学合成提供了一种绿色且可持续的替代方案，因为化学合成过程繁琐，区域选择性较差，且需要多个步骤和强氧化剂。此外，K. phaffii作为一种广泛应用于重组蛋白生产的酵母平台——能够高效分泌表达工业用酶——近年来也被证实是用于生产重组过氧化酶的理想宿主。

图形摘要