一种用于Phaffia komagataella的先进基因组工程平台，可实现多样化的体内DNA组装与多重整合

《Journal of Biological Engineering》：An advanced genome engineering platform for Komagataella phaffii enabling versatile in vivo DNA assembly and multiplex integration

　　

摘要

背景

向可持续生物经济转型需要开发出能够实现C1化学物质转化的强大微生物平台，尤其是将甲醇转化为高价值化学品的能力。Komagataella phaffii因其天然的甲醇利用途径以及高密度发酵能力，成为此类应用中的理想甲基营养型宿主。然而，由于同源重组效率低下以及多基因通路整合的技术复杂性，其作为基于C1的合成生物学底盘的潜力受到了限制。为加快以甲醇为基础的生物制造的设计-构建-测试-学习循环，需要更先进且高通量的基因组工程工具箱。

结果

我们报告了一种经过HR增强处理的K. phaffii底盘（dKR），该底盘是通过在染色体水平上协同删除Ku70并过表达RAD52而获得的。这一改造显著提升了CRISPR/Cas9介导的基因组编辑的稳定性和重复性，使用50碱基对的短同源臂时，整合效率从野生型的15.3%提升到了dKR底盘的68.1%。该平台在无需载体的多片段组装方面表现出色，九个线性DNA片段的整合效率可达86.5%。此外，通过引入tRNA-核酶CRISPR系统，可在三个不同的基因组位置同时实现多位点整合，效率为44.6%。值得注意的是，该底盘还能以44.8%的效率直接在体内组装十个片段（9个片段+1个骨架），从而有效避免了基于E. coli的克隆过程。通过类胡萝卜素生物合成途径的功能验证，该底盘能够在保持正常细胞生长和代谢产率的同时生产β-胡萝卜素。

结论

本研究建立了一个功能多样的基因组工程平台，使K. phaffii从单纯的蛋白质表达宿主转变为可广泛应用的生物工程底盘。该平台通过简化细胞设计并实现可重复的多基因整合，支持合成生物学、代谢工程以及生物生产等多领域应用。从更广泛的角度来看，这项研究展示了如何通过合理调控DNA修复途径来提升非传统宿主中的基因组工程性能，为多个领域的生物工程提供了可借鉴的设计原则。