已报道小分子P2Y6受体（P2Y6R）拮抗剂的调查研究

《Medicinal Chemistry Research》：Investigation of reported small molecule P2Y6 receptor antagonists

　　

在过去十年中，P2Y6受体（P2Y6R）领域的关注度显著增加，其背后的驱动力在于药理学抑制在神经退行性疾病模型、炎症性病理改变及癌症中均表现出显著的获益。然而，由于缺乏可用的类药性分子，针对P2Y6R的治疗性靶向一直是一项挑战。2023年和2024年，苯并咪唑和喹啉两类化学型分别被报道为强效的P2Y6R拮抗剂，并在炎症性肠病模型中展现出药理学相关性。在本研究中，研究人员从每类化学型中选择了阳性和阴性对照，并在进行化学多样化改造之前评估了它们在人源P2Y6R（hP2Y6R）上的功能活性。与已发表的文献相反，本文报道的钙（Ca2+）动员测定显示，没有任何一种拮抗剂表现出功能活性。这些发现强调了在hP2Y6R上可靠评估药理学活性所面临的持续挑战，并突显了该领域进展的一个关键障碍。

研究背景与意义

P2Y₆受体（P2Y₆R）是一种G_q蛋白偶联受体（GPCR），广泛表达于外周和中枢神经系统的多种细胞类型中。当被细胞外尿苷二磷酸（UDP）激活后，P2Y₆R会刺激三磷酸肌醇（IP₃）的产生，启动磷脂酶C（PLC）信号级联反应，导致细胞内Ca²⁺水平持续升高，进而促进促炎细胞因子和趋化因子的产生与释放。此外，P2Y₆R还充当吞噬作用的传感器，使其在炎症响应中发挥关键作用。尽管针对P2Y₆R的治疗潜力在神经退行性疾病、癌症和动脉粥样硬化等多种病理过程中得到了越来越多的支持，但由于缺乏可转化的类药性抑制剂，该领域的进展依然受限。目前，体外和体内研究的金标准是MRS2578，但由于其水溶性低且化学反应性强，无法转化为临床应用。同时，已报道的其他化学型（如2H-色烯类似物）也存在构效关系（SAR）平坦及脱靶效应等问题。因此，开发新型P2Y₆R拮抗剂化学型迫在眉睫。2023年和2024年，研究人员分别报道了吡唑-苯并咪唑和吡唑啉-喹啉两类新型化学型，显示出低纳摩尔级的强效活性，这为P2Y₆R拮抗剂的发展带来了新的希望。

技术方法概述

本研究采用了多学科交叉的技术手段。首先，研究人员通过有机合成路线分别制备了苯并咪唑和喹啉衍生物的阳性与阴性对照化合物。其次，利用计算化学方法，包括基于模板的同源建模和基于AlphaFold（AF）的同源建模，对先导化合物进行了分子对接（Redocking）验证。随后，研究人员利用稳定转染人源P2Y₆R的132-1N1细胞系，通过Ca²⁺动员测定（Fluo-4 NW检测法）评估了化合物的功能性拮抗活性。为了排除实验条件差异导致的偏差，研究人员还考察了不同激动剂浓度（EC₈₀vs 饱和浓度）、不同孵育时间（有无预孵育）以及不同细胞系（HEK293、CHO、132-1N1）对实验结果的影响。此外，独立的第三方合同研究组织（Eurofins Scientific）也参与了盲法验证实验。

研究结果

合成

研究人员成功合成了目标验证化合物1和3（苯并咪唑类）以及2和4（喹啉类）。苯并咪唑类似物是通过醛中间体的后期多样化合成的，而喹啉衍生物则是通过改进文献路线合成的。这些化合物的结构均通过核磁共振（NMR）和高分辨质谱（HRMS）等手段进行了确证。

In silico（计算机模拟）

红对接实验未能重现原文献中报道的化合物结合模式。在基于模板的同源模型中，无论是刚性靶点对接（RTD）、诱导契合对接（IFD）还是不同力场（OPLS2005和OPLS4）的应用，均无法复现原文献的结合构象。虽然基于AlphaFold建立的同源模型显示化合物5?1具有更优的对接评分和明显的π-π堆积相互作用，但该模型的主链与模板模型相比，RMSD值仅为1.8 ?。此外，原模板模型基于P2Y1受体（P2Y1R）构建且仅共享28%的氨基酸序列同一性，这种低同一性可能导致了错误的折叠分配。分析表明，异构体形式（互变异构体和对映体）虽然对接评分相似，但其结合模式的差异可能会影响功能活性，这进一步证实了分子对接预测的局限性。

In vitro（体外实验）

在hP2Y6R转染的132-1N1细胞中进行的Ca²⁺动员测定显示，在10 μM浓度下，化合物1至4均未表现出对UDP诱导的Ca²⁺动员的显著抑制作用，这与原文献报道的高活性形成鲜明对比。作为对照的非选择性P2拮抗剂PPADS和选择性拮抗剂MRS2578在不同条件下表现各异：PPADS在30分钟预孵育后能显著降低Ca²⁺通量，而MRS2578由于在水溶液中溶解度极低且容易沉淀，导致其抑制效果不稳定且无法完全消除信号。即使在高达10,000 nM的UDP浓度下，化合物1至4依然未能展现出有效的拮抗作用。

讨论与结论

讨论

研究结果的巨大差异可能源于多个实验参数的不同。首先是细胞类型的选择：原文献中观察到拮抗作用的团队使用的是HEK293或CHO细胞，而本研究及同样未检测到活性的第三方机构使用的是132-1N1细胞。野生型HEK293和CHO细胞本身表达内源性P2受体（如P2Y1R、P2Y2R、P2Y11R和P2Y14R），这可能引起UDP介导的脱靶Ca²⁺信号。例如，P2Y14R也能被UDP强烈激活，而PPADS对其无拮抗作用。相比之下，132-1N1细胞是“空白”细胞系，缺乏内源性嘌呤受体活性，能更准确地反映hP2Y6R的信号。其次是激动剂浓度和预孵育时间：原文献使用的UDP浓度远超其EC₅₀值，这可能导致了非特异性的脱靶效应；而预孵育步骤则影响了具有缓慢结合动力学的拮抗剂（如PPADS）的活性评估。这些发现强调了建立稳健、可重复的功能测定方法对于P2Y₆R拮抗剂临床转化的重要性。

结论

本研究表明，先前报道的化合物1至4在本文的实验条件下，在hP2Y6R上未表现出显著的功能活性。这些结果在132-1N1细胞中得到了反复验证，不受预孵育步骤和不同浓度激动剂UDP的影响。重要的是，这些观察结果得到了第三方研究机构的支持，并与后续报道的相关文献一致。计算机模拟实验同样产生了与原文献相矛盾的结果，先导化合物1和2均未能通过红对接实验验证。综上所述，这些结果凸显了建立更准确的P2Y₆R同源模型以支持未来基于结构的药物设计的迫切需求。当前的工作作为一个警示案例，说明了在评估P2Y₆R功能活性时可能出现的方法学不一致性，从而强调了建立稳健、可重复的功能测定方法的迫切需要——这是实现P2Y₆R拮抗剂向临床开发转化的关键障碍。