一种新型重组禽偏肺病毒(avian metapneumovirus, aMPV) B亚型疫苗候选株对鸡新型变异株传染性法氏囊病病毒(novel variant infectious bursal disease virus, nVarIBDV)提供完全保护

《Veterinary Research》：A new recombinant avian metapneumovirus vaccine candidate provides complete protection against the novel variant infectious bursal disease virus in chickens

　　

摘要：传染性法氏囊病(infectious bursal disease, IBD)是由传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus, IBDV)引起的鸡急性、高度接触性、免疫抑制性疾病。近年来出现的新型变异株IBDV(novel variant IBDV, nVarIBDV)对全球家禽业构成重大威胁，而现有商品化疫苗对nVarIBDV仅能提供有限保护。本研究以减毒aMPV/B亚型毒株LN16-A为骨架，在其G基因与L基因之间插入nVarIBDV VP2基因，成功拯救获得重组病毒rLN16A-nVarVP2。免疫荧光(immunofluorescence)和Western blotting分析证实VP2蛋白在体外稳定表达。进一步评价显示VP2的插入未改变亲本病毒的生长动力学，且连续传代20次后外源基因表达仍保持稳定。SPF鸡单次接种rLN16A-nVarVP2可诱导强烈的体液免疫和细胞免疫应答，产生抗nVarIBDV和抗aMPV/B的高滴度中和抗体，以及Th1型(IL-2、IFN-γ)和Th2型(IL-4、IL-6)细胞因子。此外，rLN16A-nVarVP2对nVarIBDV和aMPV/B攻毒均提供完全(100%)保护，完全预防法氏囊萎缩及aMPV/B感染相关的临床症状，并显著降低法氏囊内nVarIBDV病毒载量及鼻裂中aMPV/B排毒量。研究结果表明，rLN16A-nVarVP2是一种有前景的、可同时预防nVarIBDV和aMPV/B感染的活 attenuated 双价疫苗候选株。

论文解读：重组禽偏肺病毒B亚型载体表达nVarIBDV VP2基因的双价疫苗研究

研究背景与意义

传染性法氏囊病病毒(IBDV, infectious bursal disease virus)感染鸡法氏囊，引起急性、高度接触性、免疫抑制性疾病，严重危害全球家禽业。IBDV主要分为经典株(cIBDV)、变异株(varIBDV)、超强毒(vvIBDV)及近年广泛流行的新型变异株(nVarIBDV, novel variant IBDV)。nVarIBDV自2017年以来在中国、日本、马来西亚、韩国等地流行，现有针对vvIBDV的商业疫苗无法对其提供充分保护，导致免疫逃逸和法氏囊萎缩引起的长期免疫抑制。禽偏肺病毒(avian metapneumovirus, aMPV)属肺病毒科(Pneumoviridae)Metapneumovirus属，其中aMPV/B亚型可致鸡肿头综合征(swollen head syndrome, SHS)，其负链RNA基因组具有容纳外源基因的灵活性。前期研究中，研究人员通过Vero细胞连续传代致弱获得aMPV/B减毒株LN16-A，证实无返强风险。本研究首次以LN16-A为载体表达nVarIBDV主要保护性抗原VP2蛋白，旨在开发对抗nVarIBDV与aMPV/B的双价活疫苗候选株，论文发表于《Veterinary Research》。

主要关键技术方法

研究人员以实验室保存的强毒aMPV/B LN16-V(GenBank: MH745147.1)、nVarIBDV SHG19株(Segment A: MH879045; Segment B: MH879092)及减毒aMPVB全长cDNA质粒pOK-LN16A、辅助质粒(pCAGGS-N/P/M2-1/L)、nVarIBDV VP2表达质粒pCAGGS-VP2为材料。采用反向遗传学(reverse genetics)系统在BSR-T7/5细胞中共转染全长质粒与辅助质粒拯救重组病毒rLN16A-nVarVP2(VP2表达盒插入G与L基因间)。通过免疫荧光(IFA)和Western blotting验证VP2表达；连续传代20次评估遗传稳定性；生长曲线比较亲本与重组病毒复制动力学。SPF白来航鸡(Specific pathogen-free White Leghorn chickens, 21日龄)随机分组，单侧滴鼻免疫rLN16A-nVarVP2(5000 TCID₅₀/只)，设PBS对照组和健康对照组；分别于7、14、21天采血测中和抗体及Th1/Th2细胞因子(ELISA)；21天分别用nVarIBDV SHG19(10 BID₅₀, 鼻眼联合)和aMPV/B LN16-V(5000 TCID₅₀, 滴鼻)攻毒，评估法氏囊体重指数(bursa-to-body weight index, BBIX)、器官病理组织学、法氏囊nVarIBDV病毒载量(RT-qPCR靶基因VP5)及鼻裂aMPV/B排毒量(RT-qPCR靶基因G)。

研究结果

Construction and recovery of recombinant aMPV/B expressing the nVarIBDV VP2 gene（重组aMPV/B表达nVarIBDV VP2基因的构建与拯救）

将含nVarIBDV VP2基因的表达盒克隆入pOK-LN16A质粒G-L基因间隔区，共转染BSR-T7/5细胞经反向遗传学拯救获得rLN16A-nVarVP2。Western blotting检出约48.5 kDa VP2特异性条带，IFA可见VP2(红色)与aMPV N蛋白(绿色)共表达。生长曲线显示rLN16A-nVarVP2与亲本rLN16-A复制效率相当(P>0.05)，表明VP2插入不影响病毒生长动力学。连续传代至F5、F10、F15、F20均能PCR扩增出完整VP2基因(1886 bp)且Western blotting证实VP2稳定表达，证明重组病毒遗传稳定。

Humoral immune responses induced by rLN16A-nVarVP2（rLN16A-nVarVP2诱导的体液免疫应答）

SPF鸡单次免疫后，抗nVarIBDV中和抗体效价7 dpv为3.1 log₂、14 dpv为6 log₂、21 dpv达8.8 log₂；抗aMPV/B中和抗体效价7 dpv为4.8 log₂、14 dpv为6.4 log₂、21 dpv达8.6 log₂；未免疫组均为阴性。表明单次免疫即可诱导针对两种病原体的高水平中和抗体。

Cell-mediated immune responses induced by the rLN16A-nVarVP2（rLN16A-nVarVP2诱导的细胞免疫应答）

ELISA检测血清细胞因子：7 dpv时IFN-γ(136 pg/mL)较未免疫组升高约4.8倍，IL-2、IL-4、IL-6与对照组相当；14 dpv和21 dpv时IFN-γ(峰值201 pg/mL)、IL-2(峰值152 pg/mL)、IL-4(峰值148 pg/mL)显著升高(P<0.001)，IL-6先升后略降但仍高于对照组。表明rLN16A-nVarVP2有效激活Th1(IL-2、IFN-γ)和Th2(IL-4、IL-6)型细胞免疫应答。

Protective efficacy of rLN16A-nVarVP2 against nVarIBDV and aMPV/B in chickens（rLN16A-nVarVP2对nVarIBDV和aMPV/B的保护效力）

nVarIBDV SHG19攻毒后，未免疫组全部出现法氏囊显著萎缩、发黄及炎性渗出，BBIX<0.7；rLN16A-nVarVP2免疫组法氏囊外观正常，BBIX>0.7，无萎缩。aMPV/B LN16-V攻毒后，未免疫组3 dpc出现浑浊鼻液，6 dpc发病率100%；rLN16A-nVarVP2免疫组无任何临床症状，发病率0%。表明单次免疫提供对nVarIBDV和aMPV/B各100%完全保护。

Determination of nVarIBDV viral loads and aMPV/B viral shedding（nVarIBDV病毒载量测定与aMPV/B排毒检测）

nVarIBDV攻毒后7 dpc，未免疫组法氏囊、肾、脾病毒载量分别为10^4.5、10^3.1、10^3.5copies/10⁶cells；rLN16A-nVarVP2免疫组相应器官病毒载量分别降低10^3.3、10^2.7、10^3.2倍。aMPV/B攻毒后，未免疫组鼻裂排毒峰值达10^6.1copies/mL(3 dpc)，rLN16A-nVarVP2免疫组排毒量≤10^2.4copies/mL，降低10^3.7倍。表明疫苗显著抑制靶器官病毒复制和上呼吸道排毒。

Histopathological analysis of bursa and turbinate tissues（法氏囊与鼻甲骨组织病理学分析）

nVarIBDV攻毒后未免疫组法氏囊滤泡萎缩、间质增生、淋巴细胞大量缺失；rLN16A-nVarVP2免疫组与健康对照组均无病理损伤。aMPV/B攻毒后未免疫组鼻甲骨黏膜下大量炎性细胞浸润，rLN16A-nVarVP2免疫组无病变。表明rLN16A-nVarVP2完全阻止两种病毒所致靶器官组织病理学损害。

讨论与结论总结

讨论指出nVarIBDV已成为我国家禽优势流行株，现有vvIBDV疫苗因抗原不匹配无法提供充分保护。aMPV负链RNA基因组可稳定容纳外源基因，减毒LN16-A无关键毒力基因(F/G)突变及体内返强风险，适合作疫苗载体。本研究首次用aMPV/B载体表达nVarIBDV VP2并系统评价免疫效果，rLN16A-nVarVP2连续传代稳定，单次免疫诱导高于其他VP2载体疫苗的中和抗体水平(抗nVarIBDV达2^8.8)，同时激活Th1/Th2细胞免疫，对nVarIBDV和aMPV/B攻毒均实现100%保护，完全阻止法氏囊萎缩与aMPV/B临床症状，大幅降低器官病毒载量与排毒，且因aMPV载体不被IBDV母源抗体(maternally derived antibodies, MDA)中和，有望克服传统IBDV活疫苗受MDA干扰的缺陷。

结论（翻译）：

综上所述，研究人员以减毒aMPV/B亚型LN16-A为骨架构建了首株表达nVarIBDV VP2基因的双价疫苗候选株rLN16A-nVarVP2，其对nVarIBDV和aMPV/B均提供完全保护。体外与体内评价表明rLN16A-nVarVP2安全有效，对开发新型多价载体禽用疫苗具有重要意义，此类双价疫苗候选株在改善全球家禽业疾病防控、降低经济损失方面具有重要潜力。