溶血素EthA是一种诱导巨噬细胞PANoptosis的埃德瓦氏菌T3SS效应蛋白

《Veterinary Research》：Hemolysin EthA is an Edwardsiella T3SS effector that induces PANoptosis in macrophages

　　

摘要：埃德瓦氏菌（*Edwardsiella piscicida*）是一种肠道胞内细菌病原体。据报道，该细菌产生两种类型的溶血素：分泌型成孔毒素HlyA和细胞相关毒素EthA。已有研究报道，EthA通过结合外膜囊泡（outer membrane vesicles, OMVs）进入上皮细胞，一旦进入宿主细胞，它便从OMVs中释放脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）以诱导细胞焦亡（pyroptosis）。研究人员在此报告了EthA被分泌并递送入宿主细胞的另一条途径：即E. piscicida的III型分泌系统（type III secretion system, T3SS）。研究人员通过删除*ethB-ethA*操纵子上游的Fur结合基序，构建了高表达EthA的ΔFur box-P_ethB菌株。该ΔFur box-P_ethB菌株以T3SS依赖的方式在小鼠巨噬细胞中诱导PANoptosis（细胞焦亡、凋亡和坏死性凋亡的组合）。高表达的EthA部分通过NLRP3炎症小体（inflammasome）刺激细胞焦亡，并同时诱导凋亡（apoptosis）和坏死性凋亡（necroptosis），这些现象通过TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记）染色阳性细胞比例升高、裂解的caspase-3和磷酸化MLKL蛋白水平升高得到证实。PANoptosis的特征是细胞肿胀、膜破裂和细胞起泡。此外，高表达的EthA抑制丝氨酸/苏氨酸激酶TAK1和转录因子p65的磷酸化，阻止磷酸化的p65核转位进入小鼠巨噬细胞。总之，EthA被鉴定为E. piscicida中一种新型的T3SS底物。其高表达抑制TAK1的磷酸化，从而增强PANoptosis并阻断炎症通路。

**论文解读：溶血素EthA作为埃德瓦氏菌的新型T3SS效应蛋白通过抑制TAK1磷酸化诱导巨噬细胞PANoptosis**

**研究背景与目的**
*Edwardsiella piscicida*是一种革兰氏阴性肠道胞内致病菌，主要引起鱼类出血性败血症，但也逐渐成为一种人类感染病原体。该细菌在宿主巨噬细胞内的含爱德华氏菌液泡（*Edwardsiella*-containing vacuoles, ECVs）中复制，其复制依赖于活跃的III型分泌系统（type III secretion system, T3SS）。T3SS是一个多组分的针状结构，能够将效应蛋白直接注射入宿主细胞，从而促进细菌的生存和复制。目前，已有多种T3SS效应蛋白被鉴定，它们通过不同机制促进感染，例如EseJ通过抑制活性氧的产生和PANoptosis来促进细菌复制，EseH则通过抑制丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信号通路和促进p65降解来发挥作用。

已知*E. piscicida*产生两种溶血素：分泌型成孔毒素HlyA和细胞相关溶血素EthA。先前研究报道，EthA通过结合外膜囊泡（outer membrane vesicles, OMVs）进入上皮细胞，并在细胞内释放脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）以诱导细胞焦亡。然而，最新的蛋白质组学研究发现，EthA可能部分通过T3SS途径分泌。这提示存在一条递送EthA进入宿主细胞的新途径。本研究旨在探究EthA是否作为一种T3SS效应蛋白发挥作用，并阐明其进入宿主细胞后对巨噬细胞死亡方式及信号通路的影响，从而深入理解*E. piscicida*的致病机制。

**主要技术方法**
研究人员主要采用了以下技术：1. **构建突变菌株**：利用λ-Red重组系统，通过删除*ethB-ethA*操纵子上游的Fur盒（Fur box），构建了高表达EthA的ΔFur box-P_ethB菌株；并构建了*ethA*基因敲除株（Δ*ethA*）和T3SS关键组分缺失株（Δ*esaN*）。此外，对染色体上的*ethA*和*eseG*基因分别进行2HA和3FLAG标签标记。
2. **蛋白质易位和分泌检测**：采用CyaA报告系统，将EthA_{1-338 aa}与CyaA融合，通过检测宿主细胞内cAMP水平评估EthA的易位效率。同时，通过细胞分级分离和免疫印迹（Immunoblotting）检测宿主细胞可溶组分中的标签蛋白，直接验证蛋白易位。
3. **细胞死亡与信号通路分析**：通过乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）释放实验评估细胞膜完整性；利用TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记）染色和免疫荧光染色技术分别检测DNA片段化和p65核转位；采用免疫印迹法分析关键蛋白（如caspase-1, GSDMD, caspase-3, MLKL, TAK1, p65）及其磷酸化或活化形式。
4. **体内毒力评价**：使用斑马鱼幼虫模型，通过浸泡感染，记录生存率并测定细菌载量。所有实验中的*E. piscicida* PPD130/91菌株及其衍生菌株均在含有5% CO₂的DMEM培养基中于25 °C培养以激活T3SS。

**研究结果**

1. **溶血素EthA主要以T3SS依赖的方式进行分泌和易位**
研究人员构建了ΔFur box-P_ethB菌株，该菌株去除了Fur蛋白的结合位点，从而解除了Fe²⁺-Fur复合物对*ethB-ethA*操纵子的转录抑制，导致EthA蛋白水平显著升高。在ΔFur box-P_ethB菌株背景下，T3SS的功能缺失（*esaN*基因敲除，Δ*esaN*）导致EthA的分泌和向宿主细胞的易位均显著减少。通过CyaA报告基因实验和细胞分级分离结合免疫印迹分析，研究人员证实T3SS是EthA进入宿主细胞的主要途径。

2. **T3SS易位的EthA在小鼠巨噬细胞中诱导PANoptosis**
研究发现，感染ΔFur box-P_ethB菌株的J774A.1巨噬细胞出现了细胞肿胀、起泡等形态学变化，并伴随LDH释放显著增加，表明细胞膜破裂。进一步的免疫印迹结果显示，该菌株感染诱导了caspase-1的裂解（p20）和Gasdermin D（GSDMD）的裂解，这是细胞焦亡的标志。NLRP3抑制剂MCC950可部分抑制caspase-1的裂解，提示EthA诱导的焦亡部分依赖于NLRP3炎症小体。同时，感染ΔFur box-P_ethB菌株还导致了裂解的caspase-3（凋亡执行者）水平升高，以及TUNEL染色阳性细胞比例增加，证明凋亡被诱导。此外，磷酸化的MLKL（p-MLKL，坏死性凋亡的执行者）蛋白水平也显著升高。这些结果共同表明，T3SS递送的EthA能够同时刺激细胞焦亡、凋亡和坏死性凋亡，即诱导PANoptosis。

3. **T3SS易位的EthA抑制NF-κB信号通路**
研究人员检测了感染后巨噬细胞中TAK1和p65的活化情况。结果发现，与野生型菌株感染相比，ΔFur box-P_ethB菌株感染显著抑制了TAK1的磷酸化，并抑制了p65的磷酸化。免疫荧光染色进一步证实，感染ΔFur box-P_ethB菌株后，p65发生核转位的巨噬细胞比例显著低于野生型菌株感染组，而T3SS缺失菌株则导致p65核转位比例升高。这表明EthA通过抑制TAK1的磷酸化，进而抑制了NF-κB信号通路的激活。

**总结与讨论**

本研究揭示了*E. piscicida*中溶血素EthA的一条全新的递送途径——T3SS。在细胞内，EthA的功能被确定为一种新型T3SS效应蛋白。其关键作用机制是通过抑制激酶TAK1的磷酸化，从而解除TAK1对PANoptosis的负调控，最终诱导巨噬细胞发生同时具有焦亡、凋亡和坏死性凋亡特征的PANoptosis。同时，EthA还通过抑制p65的磷酸化和核转位来阻断NF-κB炎症信号通路。

研究结果表明，高表达EthA的ΔFur box-P_ethB菌株在斑马鱼幼虫模型中显示出更强的毒力（更高的死亡率）和更高的体内定殖能力，而敲除*ethA*基因则显著减弱细菌毒力，这表明EthA对于*E. piscicida*在宿主体内的适应性和致病性至关重要。

**结论部分翻译**
“总之，*E. piscicida*中的溶血素EthA能够通过T3SS被递送入宿主细胞。一旦易位，EthA便抑制TAK1的磷酸化，而TAK1是PANoptosis的一个关键负调控因子。因此，EthA刺激巨噬细胞中的PANoptosis，并抑制p65蛋白的磷酸化。这种新型T3SS效应蛋白EthA通过抑制炎症信号通路来增强*E. piscicida*的适应度，从而促进其在体内的复制。这些发现加深了研究人员对不同细菌病原体产生的溶血素的致病机制的理解。”