《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》：S-phase targeted treatment triggers caspase-dependent lytic immunogenic cell death with pyroptotic features in cancers
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免疫原性细胞死亡（ICD）是一种通过释放损伤相关分子模式（DAMPs）和细胞因子来增强化疗和靶向治疗抗肿瘤免疫应答的细胞死亡类型，这些分子可激活树突状细胞和T细胞，从而调动患者的免疫系统对抗癌症。焦亡和坏死性凋亡具有强免疫原性，因为它们通过成孔蛋白释放DAMP
免疫原性细胞死亡（ICD）是一种通过释放损伤相关分子模式（DAMPs）和细胞因子来增强化疗和靶向治疗抗肿瘤免疫应答的细胞死亡类型，这些分子可激活树突状细胞和T细胞，从而调动患者的免疫系统对抗癌症。焦亡和坏死性凋亡具有强免疫原性，因为它们通过成孔蛋白释放DAMPs和炎症信号，而凋亡则可能具有耐受原性。这种免疫原性反应依赖于功能性免疫系统。不幸的是，大多数常规化疗和许多靶向治疗也会损害免疫系统。在此，研究人员研究了肿瘤选择性治疗——检查点激酶1抑制剂（CHK1i）联合低剂量羟基脲（LDHU）促进ICD和抗肿瘤免疫的机制。研究人员证明，CHK1i+LDHU诱导S期阻滞和具有焦亡特征的caspase依赖性裂解性细胞死亡，包括gasdermin E（GSDME）的切割，但细胞死亡并不完全依赖于gasdermin的切割。抑制caspase足以阻断肿瘤细胞杀伤和治疗免疫原性。该机制不依赖于任何单一的caspase或gasdermin，这与多个caspase依赖性过程的贡献一致。相比之下，主要触发凋亡的多柔比星在刺激抗肿瘤免疫应答方面效果较差，尽管其诱导了相似水平的细胞死亡。这些发现表明，具有焦亡特征的caspase依赖性裂解性细胞死亡为抗肿瘤免疫提供了更有效的刺激信号。
**论文解读：S期靶向治疗触发caspase依赖性裂解性免疫原性细胞死亡及其在癌症治疗中的意义**
**研究背景与问题**
免疫原性细胞死亡（ICD）是一种能够增强抗肿瘤免疫应答的细胞死亡形式，通过释放损伤相关分子模式（DAMPs）和细胞因子，激活树突状细胞和T细胞，进而调动患者免疫系统对抗癌症。焦亡和坏死性凋亡因通过成孔蛋白释放DAMPs和炎症信号而具有强免疫原性，而凋亡则可能具有耐受原性。然而，大多数常规化疗和许多靶向治疗在杀伤肿瘤细胞的同时也会损害免疫系统，限制了其临床疗效。因此，开发既能有效杀伤肿瘤细胞又能激发强效抗肿瘤免疫的治疗策略至关重要。检查点激酶1抑制剂（CHK1i）联合低剂量羟基脲（LDHU）是一种高度靶向的治疗方案，此前研究已表明其能促进促炎细胞因子表达和ICD，并在体内增强抗肿瘤免疫。然而，其诱导细胞死亡的具体分子机制，特别是与免疫原性相关的细胞死亡模式，尚不完全清楚。本研究旨在深入解析CHK1i+LDHU诱导的细胞死亡机制，阐明其如何通过特定细胞死亡途径触发抗肿瘤免疫，并评估其相对于传统化疗（如多柔比星）在免疫激活方面的优势。
**研究内容与结论**
研究人员通过一系列体外和体内实验，系统探究了CHK1i+LDHU诱导细胞死亡的模式及其免疫原性。主要发现包括：1）CHK1i+LDHU诱导S期阻滞和caspase依赖性裂解性细胞死亡，该死亡具有焦亡特征，包括gasdermin E（GSDME）切割和膜气球样变，但GSDME并非细胞死亡所必需；2）该细胞死亡依赖于caspase活性，抑制caspase可完全阻断细胞杀伤和治疗免疫原性；3）细胞死亡涉及多个caspase依赖性过程，包括线粒体外膜通透化（MOMP）和多种caspase的激活，但无单一caspase或gasdermin起主导作用；4）与主要诱导凋亡的多柔比星相比，CHK1i+LDHU诱导的裂解性死亡在体内可引发更有效的抗肿瘤免疫应答，尽管两者诱导的细胞死亡水平相似。这些发现表明，具有焦亡特征的caspase依赖性裂解性细胞死亡是更有效的抗肿瘤免疫刺激信号。
**重要意义**
该研究揭示了S期靶向治疗（CHK1i+LDHU）通过触发一种独特的caspase依赖性裂解性细胞死亡（具有焦亡特征）来增强抗肿瘤免疫的机制。这一发现为开发既能高效杀伤肿瘤细胞又能激活免疫系统的抗癌策略提供了新思路，尤其是针对S期的靶向治疗可能具有更优的免疫治疗潜力。论文发表在《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》。
**主要关键技术方法**
1. **活细胞成像分析**：使用IncuCyte S3活细胞分析系统和DeltaVision Elite荧光显微镜进行长时间动态成像，结合Sytox Green、碘化丙啶（PI）、Annexin V-AF488、DRAQ7等荧光染料，实时监测细胞死亡（裂解性死亡、凋亡）和细胞周期动态。
2. **细胞周期分析**：利用PIP-FUCCI（荧光泛素化细胞周期指示剂）细胞系，通过荧光显微镜和IncuCyte成像追踪单细胞在S期、G2期等阶段的命运，明确细胞死亡与细胞周期时相的关系。
3. **基因编辑与药物抑制**：采用CRISPR技术敲除GSDME、BAX/BAK、caspase 2/3等关键基因，以及使用多种特异性caspase抑制剂（如Q-VD-OPh、Z-DEVD-FMK、VX-765等）和RIPK1抑制剂（necrostatin），以探究各分子在细胞死亡中的作用。
4. **体内免疫原性细胞死亡（ICD）测定**：将体外处理（CHK1i+LDHU或多柔比星，加或不加caspase抑制剂）的B16小鼠黑色素瘤细胞注射免疫C57BL/6J小鼠，13天后用活B16细胞再次攻击，监测肿瘤生长和存活率，评估不同处理诱导抗肿瘤免疫应答的能力。
5. **免疫印迹与表达分析**：通过免疫印迹检测caspase-3、PARP、GSDME、GSDMD等蛋白的切割状态，并利用CCLE表达数据库分析黑色素瘤、卵巢癌和非小细胞肺癌（NSCLC）细胞系中焦亡和坏死性凋亡通路相关基因的表达谱。
**研究结果**
**CHK1i+LDHU促进caspase依赖性细胞死亡：** 研究人员在多种人黑色素瘤、卵巢癌和NSCLC细胞系中证实，CHK1i+LDHU处理可诱导caspase依赖性裂解性细胞死亡。泛caspase抑制剂Q-VD-OPh完全或部分阻断细胞杀伤，且在小鼠B16细胞中，Q-VD-OPh处理完全消除了CHK1i+LDHU诱导的肿瘤排斥反应，表明裂解性细胞死亡是抗肿瘤免疫应答的必要组成部分。
**CHK1i+LDHU触发非经典焦亡：** 研究发现，CHK1i+LDHU处理导致caspase-3激活和GSDME切割，并观察到细胞膜气球样变（焦亡特征），但未检测到经典焦亡标志物（如成熟IL-1β释放）。GSDME敲除并不阻断细胞死亡，反而加速死亡，表明GSDME切割是常见特征但非必需。GSDMD切割仅在部分细胞系中检测到，且GSDMD表达不普遍。
**CHK1i+LDHU触发多种内在caspase依赖性死亡途径：** 处理导致线粒体外膜通透化（MOMP），且此过程被caspase抑制剂阻断。BAX/BAK双敲除（DKO）细胞中细胞杀伤显著减少，表明BAX/BAK是MOMP的关键调节因子。caspase-9抑制剂对细胞杀伤和GSDME切割无影响，但BAX/BAK DKO细胞中无活化caspase-3，提示caspase-9参与caspase-3激活。caspase-1、2、8选择性抑制剂对细胞死亡影响甚微，caspase-2/3双敲除仅部分减少杀伤，说明存在功能冗余。TNFα+放线菌酮（CHX）实验表明，新蛋白合成并非处理诱导死亡所必需。
**细胞周期时相决定死亡模式：S期裂解性死亡，G2期凋亡：** 利用PIP-FUCCI细胞系追踪发现，CHK1i+LDHU处理导致细胞阻滞于S期，死亡主要发生在S期，且为裂解性死亡（膜气球样变）。多柔比星则导致G2期阻滞，细胞主要在G2期通过凋亡死亡。体内免疫实验表明，CHK1i+LDHU处理的B16细胞诱导的抗肿瘤免疫保护显著优于多柔比星处理的细胞，尽管两者诱导的caspase-3激活水平相似。
**讨论与结论**
**总结讨论：** 研究结果表明，CHK1i+LDHU通过诱导S期阻滞和MOMP依赖的裂解性细胞死亡来发挥抗肿瘤作用。这种细胞死亡具有caspase依赖性和焦亡特征（GSDME切割、膜气球样变），但GSDME并非必需，可能存在其他GSDM非依赖的caspase依赖性成孔机制（如MLKL切割）。尽管caspase-3在GSDME切割中起主要作用，但上游启动caspase仍不明确，caspase-9可能通过BAX/BAK介导的MOMP参与caspase-3激活，而caspase-2和caspase-8的作用证据不足。研究发现的另一个关键点是，S期阻滞优先触发裂解性死亡，而G2期阻滞则主要导致凋亡，这可能与不同细胞周期时相中caspase-3对GSDME等底物的可及性差异有关。由于裂解性死亡（具有焦亡特征）能更有效地诱导ICD和抗肿瘤免疫，S期靶向治疗可能提供更优的治疗选择，前提是免疫系统不受治疗损害。
**结论部分翻译：** 这些发现表明，具有焦亡特征的caspase依赖性裂解性细胞死亡为抗肿瘤免疫提供了更有效的刺激信号。
