《Plant Molecular Biology》：Tissue specific RISC-loading reassesses small RNA functionality in developing pepper fruit
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小调控RNA（sRNA），包括小干扰RNA（siRNA）和微小RNA（miRNA），是RNA干扰（RNAi）途径的组成部分，调控关键生命过程。这些不同的sRNA通过专门的执行蛋白ARGONAUTE（AGO）发挥作用，AGO蛋白构成RNA诱导沉默复合体（RISC
小调控RNA（sRNA），包括小干扰RNA（siRNA）和微小RNA（miRNA），是RNA干扰（RNAi）途径的组成部分，调控关键生命过程。这些不同的sRNA通过专门的执行蛋白ARGONAUTE（AGO）发挥作用，AGO蛋白构成RNA诱导沉默复合体（RISC）。在拟南芥中，miRNA主要装载进入AGO1，而24核苷酸（nt）长的siRNA通常装载进入AGO4。然而，大量sRNA以AGO未结合形式存在于细胞质中。为了揭示sRNA组织特异性AGO装载效率在一种经济重要植物中的潜在重要性，研究人员使用辣椒果实，将其解剖为果皮、胎座和种子，并通过高通量测序研究了AGO结合与未结合sRNA库之间的比率。与先前研究一致，发现了sRNA的可变装载能力，并存在大量AGO未结合库。所研究的库显示，即使在高分子量RISC中，21-22-24-nt长的siRNA也出人意料地高频率出现。动态扩张的果皮表现出极高的21-nt长miRNA含量。此外，比较不同组织时，观察到21-和24-nt sRNA在各种sRNA-蛋白质复合体中的剧烈重新分布或消除，以及未结合sRNA库的变化，表明sRNA的AGO装载特性存在高度动态变化。这些数据暗示，在果实发育过程中，sRNA以受控方式动态分选到各种执行复合体中。这一发现还暗示，分析AGO-sRNA复合体的内容以及这些sRNA的AGO未结合群体，可作为识别潜在功能性sRNA的有用工具。
论文解读文章
**研究背景、存在问题及研究动机**
RNA干扰（RNAi）是植物中广泛存在的调控机制，涉及多种小调控RNA（small regulatory RNAs, sRNA）种类，包括微小RNA（microRNA, miRNA）和小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）。这些sRNA通过专门的ARGONAUTE（AGO）蛋白形成RNA诱导沉默复合体（RNA induced silencing complex, RISC）发挥功能。在模式植物拟南芥中，21-核苷酸（nucleotide, nt）的miRNA主要装载进入AGO1，而24-nt的siRNA通常装载进入AGO4。然而，先前研究在拟南芥中发现大量sRNA以AGO未结合（游离）形式存在于细胞质中，这表明sRNA的装载效率是决定其生物学活性的关键因素之一。尽管在拟南芥中已初步揭示sRNA在不同分子量RISC中的分布，但在经济重要作物如辣椒（辣椒果实）中，组织特异性sRNA的AGO装载效率及其在果实发育过程中的动态变化尚未被探索。果实由果皮、胎座和种子等多种组织构成，其发育涉及复杂的分子调控网络。理解辣椒果实发育中sRNA的精细调控机制，对于揭示小RNA功能及作物改良具有重要科学和实践意义。因此，研究人员开展本研究，旨在通过分析辣椒果实不同组织中AGO结合与未结合sRNA库的分布，重新评估sRNA的功能性。
**研究内容、结论及意义**
研究人员将发育28天的辣椒果实解剖为果皮、胎座和种子三部分，通过基于快速蛋白液相色谱（Fast Protein Liquid Chromatography, FPLC）的凝胶过滤实验，分离出高分子量RISC（high molecular weight RISC, HMW-RISC）、低分子量RISC（low molecular weight RISC, LMW-RISC）和AGO未结合（游离）sRNA三个库，并进行高通量小RNA测序（high-throughput sequencing, HTS）。结论如下：1）辣椒果实中sRNA在HMW-RISC、LMW-RISC和未结合库之间的分布呈现组织特异性，且与拟南芥类似，存在大量AGO未结合sRNA；2）果皮中21-nt miRNA含量极高，而种子和胎座中24-nt siRNA在HMW-RISC中显著富集；3）不同miRNA和siRNA的装载效率因组织而异，可划分为高装载、低装载和可变装载三类；4）通过筛选高装载效率的sRNA，成功识别出两个具有潜在生物学活性的新sRNA（sRNA_DA_1和sRNA_FM_1），并验证了其组织特异性和高AGO结合能力。该研究的重要意义在于：首次在辣椒果实中证实了sRNA的AGO装载效率具有组织特异性，并表明结合装载效率分析可有效识别潜在功能性sRNA，为果实发育中小RNA功能研究提供了新方法。论文发表在《Plant Molecular Biology》。
**主要关键技术方法**
研究人员主要采用以下关键方法：1）基于FPLC的凝胶过滤实验（使用Superdex-200柱），从28天龄辣椒果实（品种‘Fehér?z?n’）的果皮、胎座和种子粗提物中分离HMW-RISC、LMW-RISC和AGO未结合库；2）使用TruSeq小RNA文库制备试剂盒（Illumina）对上述三个库及输入样本进行高通量测序（HTS），并在Illumina HiSeq 2000平台测序；3）生物信息学分析包括cutadapt修剪、去除tRNA/rRNA序列、标准化为每百万读段数（Reads Per Million, RPM），以及基于Z-score的热图分析；4）通过Northern blot和Western blot验证关键sRNA的表达模式、装载效率及AGO1蛋白丰度。样本均来自28天龄辣椒果实（Capsicum annuum ‘Fehér?z?n’）的果皮、胎座和种子。
**研究结果**
**Gel-filtration experiments reveal tissue specific AGO-loading efficiency of sRNAs in developing pepper fruit**
通过凝胶过滤实验分离辣椒果实三种组织的HMW-RISC、LMW-RISC和未结合sRNA库，并进行HTS分析。结果显示，所有组织中都存在大量AGO未结合sRNA。在果皮中，21-nt和22-nt长sRNA（典型miRNA样序列）在HMW-RISC中比例显著升高，尤其是高丰度（RPM>5）的sRNA。相比之下，种子和胎座中，24-nt和23-nt长sRNA在HMW-RISC中也有显著存在，这与拟南芥中24-nt siRNA主要存在于LMW-RISC的模式不同，表明辣椒果实中可能存在24-nt介导的HMW-RISC相关调控途径。Western blot证实果皮中AGO1蛋白丰度最高，胎座中等，种子最低。
**HTS analysis reveals various loading efficiencies of the sRNAs in pepper fruit tissues**
对已知的典型miRNA和预测的辣椒特异性miRNA进行装载效率分析。基于Z-score的热图显示，不同miRNA在三种组织中的装载效率差异显著。部分miRNA在所有组织中均高效装载至HMW-RISC（如miR159），另一部分在果皮中装载效率更高（绿色框标注），还有部分在特定组织中装载效率极低甚至无装载（黑色框标注）。此外，24-nt siRNA在种子和胎座中主要与HMW-RISC相关，但在果皮中则大幅转移至LMW-RISC（红色框标注），提示果皮中可能存在不同的RNAi路径。21-nt和22-nt siRNA在三种组织的HMW-RISC中均有高装载效率。
**Identification of potentially biologically active sRNAs based on AGO-loading capacity**
基于HTS数据，筛选出在高丰度（平均RPM>50）且至少在一个组织中装载效率超过80%的sRNA，以及装载效率低于50%的sRNA。选取了两个代表性sRNA：sRNA_DA_1（21-nt，种子特异，95%装载于HMW-RISC，靶向受体样激酶RBK2）和sRNA_FM_1（21-nt，在所有组织及物种中高表达，高装载效率，靶向Squamosa启动子结合样蛋白）。Northern blot和凝胶过滤实验验证了sRNA_DA_1在辣椒种子中的特异性表达和高HMW-RISC装载；sRNA_FM_1在所有检测样本中均有表达并高效装载。此外，对辣椒特异性miRNA can-miR-n026和can-miR-n018的分析显示，前者仅在胎座中具中等装载效率，在种子中主要以未结合形式存在；后者存在多种iso-MIR，仅在胎座中适度装载至HMW-RISC。
**总结讨论与结论**
讨论部分指出，sRNA的AGO装载效率可作为判断其生物学活性的重要指标，仅凭丰度不足以确定功能。凝胶过滤结合HTS的方法能同时分析同一组织中所有RISC相关和未结合的sRNA，有助于识别先前未知的潜在活性sRNA。研究中发现24-nt siRNA在HMW-RISC中的存在，暗示可能存在含非AGO1蛋白的未知RISC复合体。然而，由于辣椒中缺乏其他AGO蛋白的抗体，无法精确鉴定HMW-和LMW-RISC中的具体AGO组成，未来需借助拟南芥等模式系统进行更深入分析。此外，AGO未结合sRNA库的功能尚不明确，可能是生物合成的多余产物或快速装载的储备库。技术方面，HTS存在不同库间的测序偏差，可能影响装载效率计算但不会干扰高/低装载sRNA的聚类，推荐通过Northern blot等实验验证。
**结论部分翻译**：在发现RNAi途径之后，全球范围内的研究努力旨在识别具有科学和/或农学重要性的新siRNA和miRNA，以期理解特定生物学过程背后的主要分子事件。在这些努力中，确定了单个sRNA或所研究组织整个sRNA含量的表达，并仅根据某些sRNA的存在和丰度得出关于功能的结论。最近，在植物细胞中发现了一个丰富的AGO未结合sRNA库，表明只有一部分sRNA处于活性AGO结合形式（Dalmadi et al. 2019）。sRNA在AGO-RISC装载和未结合形式之间的分布是单个sRNA的特征。通过这种方式，可以通过结合丰度和装载效率的研究来确定潜在功能，只有那些不仅存在而且至少部分以AGO结合形式存在的sRNA才可被视为在给定组织中重要。本文提出的方法还可以突出那些否则未被发现但在所研究组织中可能具有活性并因此具有调控作用的未知sRNA。基于FPLC的凝胶过滤允许同时观察来自同一组织的所有RISC相关sRNA（无论复合体的AGO含量如何）以及AGO未结合库。在这项工作中，研究人员证明了sRNA向含有AGO蛋白的HMW-和LMW-RISC以及蛋白未结合库的组织特异性分选现象也存在于经济重要的辣椒植物中。从实践角度来看，研究人员提出基于凝胶过滤的sRNA复合体大小分离可以成为一种有用工具，根据sRNA装载进入执行AGO蛋白的能力，以组织特异性方式识别潜在生物学活性的sRNA种类。通过此技术识别候选sRNA可为验证这些潜在活性sRNA的功能开辟道路。
