用于定量土壤中豌豆根瘤菌生物型巢菜（根瘤菌群E/F）的分子诊断检测方法的开发

《Plant and Soil》：Development of molecular diagnostic test to quantify Rhizobium leguminosarum bv. viciae (rhizobia group E/F) in soil

　　

目的：根瘤菌对豆科植物的固氮作用至关重要。目前通过最可能数法（MPN法）计数土壤中根瘤菌的方法成本高且耗时长。本文描述了一种qPCR检测方法的开发，用于定量土壤中的豌豆根瘤菌生物型巢菜（Rlv）。方法：开发了TaqMan探针和引物。通过针对Rlv和非目标根瘤菌验证qPCR的特异性，并与巢菜结瘤进行比较。通过将已知细胞密度的Rlv菌株加入沙中，比较qPCR结果与琼脂平板计数，评估qPCR结果与Rlv数量之间的关系。在41份田间土壤上评估了该检测的可靠性，并与巢菜的MPN定量结果进行比较，同时在豌豆和蚕豆上检测了土壤提取物中根瘤菌的共生性能。结果：开发的检测对Rlv具有特异性，42个菌株的qPCR和巢菜结瘤均为阳性，另外42个其他根瘤菌的qPCR和结瘤均为阴性。将两株Rlv菌株的稀释系列接种到沙中，qPCR数据与平板计数之间产生了紧密的相关性（R²=0.92）。对田间土壤的评估表明，qPCR与MPN之间存在显著关系（P<0.001，R²=0.85），并且qPCR与豌豆（R²=0.82）和蚕豆（R²=0.51）的固氮能力之间也存在显著关系。结论：开发的qPCR检测对Rlv菌株具有特异性，并且与平板计数、MPN种群估计值和共生性能显示出高度相关性。该检测现已以“PREDICTA^? rNod”作为商业服务提供给种植者和研究人员。

**论文解读：基于qPCR技术的豌豆根瘤菌生物型巢菜（根瘤菌群E/F）土壤定量检测方法开发与应用**

**研究背景与问题**

豆科植物通过与其特异性共生细菌——根瘤菌的相互作用，将大气中的氮气（N₂)转化为植物可利用的氨（NH₃），从而减少对氮肥的依赖及其环境影响。在澳大利亚南部，豌豆、蚕豆、巢菜和小扁豆等主要豆科作物均由根瘤菌接种群E和F，即豌豆根瘤菌生物型巢菜（Rhizobium leguminosarum bv. viciae，简称Rlv）结瘤固氮。然而，土壤中有效Rlv种群数量是决定结瘤和固氮效率的关键。当土壤中每克含有效根瘤菌数量超过1000个时，额外接种通常无效；低于此水平则可能面临结瘤不足的风险。目前，测定土壤中特定根瘤菌数量的标准方法是基于植物的最可能数法（MPN法），该方法虽然可靠，但耗时、成本高，不适合作为快速诊断服务的基础。因此，研究人员迫切需要一种快速、低成本且可靠的分子检测方法，以帮助种植者在播种前评估土壤中Rlv的数量，从而指导接种决策。该研究旨在开发并验证一种基于定量聚合酶链式反应（qPCR）的检测方法，用于定量土壤中的Rlv，并最终以商业服务形式推广。

**主要技术方法**

研究人员首先针对Rlv的结瘤基因NodD设计了一对特异性引物和一条TaqMan-MGB探针（TaqMan minor groove binder assay），通过生物信息学比对验证其特异性。随后，利用84株根瘤菌（包括43株目标Rlv菌株和41株非目标菌株）进行qPCR检测与巢菜结瘤生物测定，以明确检测特异性。为建立qPCR信号与细胞数量的关系，将两株代表性Rlv菌株（WSM1455和SRDI969）以已知密度接种于无菌沙中，并行提取DNA进行qPCR定量与琼脂平板计数（cfu）。在此基础上，从南澳大利亚主要农业区（艾尔半岛、中北部、马里和东南部）采集了41份田间土壤样本（具体来源及理化性质见补充表S2），将qPCR结果与MPN法以及豌豆和蚕豆的共生性能（结瘤数和固氮能力SP%）进行相关性分析。此外，还在三个商业种植点（Lameroo、Roseworthy、Coonalpyn）评估了Rlv在田间的空间分布，比较了行上（on-row）与行间（off-row）采样及不同土壤样本间的差异。

**研究结果**

- **Development of a qPCR test for E/F inoculation group rhizobia（针对E/F接种群根瘤菌的qPCR检测方法开发）**：通过计算机模拟（in silico）和实际验证，设计的引物和探针仅与已知可结瘤目标豆科植物的根瘤菌质粒中的NodD基因区域结合。即使近期分类学上Rlv被分为多个基因种（如Rhizobium johnstonii, Rhizobium binae等），它们均含有此靶标区域，确保了检测的覆盖性。

- **Specificity of qPCR test（qPCR检测的特异性）**：对84株根瘤菌的验证显示，42株Rlv菌株的qPCR和巢菜结瘤均为阳性，1株原鉴定为Rlv的菌株两项均为阴性（为误鉴定）。其余41株非目标菌株（包括R. leguminosarum bv. trifolii, Sinorhizobium spp., Bradyrhizobium spp.等）的qPCR和结瘤均为阴性，证实该检测对Rlv具有高度特异性。

- **Correlation of Rlv qPCR test with Rlv cell density（Rlv qPCR检测与Rlv细胞密度的相关性）**：将两株Rlv菌株的稀释系列接种于沙中，qPCR结果与琼脂平板计数呈紧密线性相关（R²=0.92）。qPCR对Rlv的检测下限约为1000 cfu/g沙，低于此值（100-200 cfu/g）时检出率下降；而平板计数可检测至1 cfu/g。添加小麦籽粒可提高DNA提取效率，使qPCR检测到的细胞比例从25%提升至49%。

- **Spatial distribution of Rlv rhizobia in the field（田间Rlv根瘤菌的空间分布）**：对三个种植过接种豆科作物（2017年）的商业地块进行采样分析发现，无论是在行上还是行间采样，Rlv DNA拷贝数无显著差异（P=0.218），且不同地块间DNA数据变异较小（变异系数3.8%），而MPN法数据在相同地块内变异更大（变异系数12.7%）。这表明qPCR检测更稳定，且采样位置（行上/行间）对结果影响不显著。

- **Correlation between Rlv qPCR and MPN tests on field soils（田间土壤中Rlv qPCR与MPN检测的相关性）**：对41份田间土壤的分析显示，qPCR检测的Rlv DNA拷贝数与MPN法测定的根瘤菌数量高度相关（R²=0.85，P<0.001）。qPCR的检测下限约为200 DNA拷贝/g土壤，而MPN下限为4 MPN/g土壤。在高于MPN 200/g土壤的水平上，两者呈强线性关系。

- **Relationship between nodulation, symbiotic performance and DNA copy number（结瘤、共生性能与DNA拷贝数的关系）**：从33份阳性土壤中提取根瘤菌，接种于豌豆和蚕豆的沙-蛭石盆栽系统。结果显示，Rlv DNA拷贝数与豌豆和蚕豆的结瘤数及共生性能（SP%）均呈显著正相关。豌豆的SP%与DNA拷贝数的R²为0.82，蚕豆为0.51。当土壤中Rlv DNA拷贝数大于10,000拷贝/g时，豌豆和蚕豆的结瘤达到饱和，SP%可达到或超过商业接种菌株SU303和WSM1455的水平。低于200拷贝/g的土壤，植物几乎不结瘤，表现出缺氮症状。

**讨论与结论**

讨论部分指出，该研究开发的qPCR检测方法基于NodD基因，采用TaqMan-MGB化学体系，相比于之前文献报道的Sybr Green方法，具有更高的特异性和可重复性。该方法对Rlv特异性极强，且不与近缘生物型R. leguminosarum bv. trifolii交叉反应。在沙和田间土壤中，qPCR结果与平板计数和MPN法均高度一致，且在大于200 DNA拷贝/g土壤的范围内可靠。田间空间分布研究表明，Rlv在农田中的分布相对均匀，使得现有采样方案（如PREDICTA^? B测试的采样策略）可直接应用于该检测。与MPN法相比，qPCR不仅更快、成本更低，而且变异性更小。该检测方法已作为商业服务“PREDICTA^? rNod”向种植者和研究人员提供，可用于指导接种决策。

研究结论：开发的qPCR检测对Rlv菌株具有特异性，且与平板计数、MPN种群估计值和共生性能显示出高度相关性。该检测现可供种植者用于指导接种策略，支持研究人员开展田间研究（https://pir.sa.gov.au/research/services/molecular_diagnostics/predicta_rnod）。