内生真菌Aspergillus glaucus作为一种新型Epothilone B产生菌：抗增殖活性与计算分析（In silico analysis）

《Applied Microbiology and Biotechnology》：Endophytic Aspergillus glaucus as a novel epothilone B producer: Antiproliferative activity and in silico analysis

　　

Epothilones是一类最有效的抗癌剂之一，尤其针对耐药肿瘤，归因于其对β-微管蛋白（β-tubulin）稳定的高亲和力，抑制微管解聚，最终导致细胞周期阻滞。然而，其天然来源的有限性限制了更广泛的临床和工业开发。因此，本研究旨在筛选具有可持续和高代谢能力的新型真菌分离株用于Epothilone生产。研究人员从棕榈树Latania lontaroides中分离的内生真菌Aspergillus glaucusOR342865.1，经响应面法（Response Surface Methodology）优化后表现出最高的Epothilone生产力（240 μg/L）。纯化化合物的化学身份通过不同的色谱和光谱分析解析，揭示了与 authentic Epothilone B一致的结构特征。推定的Epothilone B对HepG-2、MCF-7和HCT-116细胞系显示出强效的细胞毒性活性，半抑制浓度（IC50）值分别为0.028、0.034和0.13 μM，相对于Vero细胞的选择性指数（Selectivity Indices）分别为12.5、10.3和2.7。抗侵袭实验表明，处理后MCF-7和HepG-2细胞的迁移能力显著抑制（35.5–40.2%），表明其抗转移潜力。细胞周期分析显示Epothilone处理诱导HepG-2细胞G1期阻滞，较对照组增加55.03%。总凋亡和早期凋亡群体分别增加至32.2%和22.03%，而晚期凋亡较未处理细胞升高57.6倍。当作为斜面培养物在4 °C保存时，A. glaucus对Epothilone B的生物生产能力稳定维持长达6个月。分子对接（Molecular Docking）分析表明，Epothilone B除结合β-微管蛋白紫杉醇位点（β-tubulin taxane site）外，还与关键致癌激酶包括SRC、EGFR、JAK2、PIK3CA、mTOR和HSP90表现出连贯的多靶点相互作用，突显其调节多种癌症相关信号通路的能力。据研究人员所知，这是首次报道A. glaucus产生Epothilone B的高代谢潜力，将该真菌定位为这一临床有价值抗癌剂可持续工业规模生物合成的有前景平台。

本研究发表于《Applied Microbiology and Biotechnology》。研究背景方面，Epothilones是源自黏细菌Sorangium cellulosum的天然大环内酯类（Macrolides）杂交次级代谢产物，通过聚酮化合物（Polyketide）和非核糖体肽（Nonribosomal peptide）生物合成途径衍生，具有环氧、噻唑和酮基官能团。其抗癌功效主要归因于与β-微管蛋白（β-tubulin）的高结合亲和力，稳定微管并抑制去聚合，从而在G2/M期阻滞细胞分裂。尽管Epothilones与Taxol共享β-微管蛋白共同分子靶点且具备更高水溶性、更低分子量及更低结合能等理化优势，尤其对耐药肿瘤表型有效，但S. cellulosum生长极慢及产量极低限制了其作为商业化生产平台的可行性及大规模临床应用。近期虽有Aspergillus fumigatus和Aspergillus niger等真菌被报道可产生Epothilone B，但真菌储存及反复传代过程中Epothilone生产力的渐进性下降仍是主要挑战。因此，筛选具有增强Epothilone生产力及长期生物合成稳定性的新型真菌分离株成为首要目标。研究人员从具有民族药理学意义的棕榈科（Arecaceae）植物Latania lontaroides中分离内生真菌，评估其Epothilone生产能力及生物合成稳定性，并阐明所产Epothilone的化学身份与生物学活性。结论表明Aspergillus glaucusOR342865.1是极具潜力的Epothilone B产生菌，为可持续工业规模生物合成该抗癌剂提供了新平台，具有重要意义。

研究人员开展研究用到的主要关键技术方法包括：从埃及El-Abd Garden采集L. lontaroides叶片进行表面消毒并分离内生真菌；基于抗真菌活性（针对Aspergillus flavus）引导筛选及薄层色谱（TLC）、高效液相色谱（HPLC）初步定量Epothilone生产；通过内部转录间隔区（ITS）区域序列分析进行真菌分子鉴定；利用紫外-可见光谱（UV-Vis）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、质子核磁共振（¹HNMR）及液相色谱-电喷雾电离串联质谱（LC/ESI–MS/MS）进行化学结构验证；采用MTT法评估对HepG-2、MCF-7、HCT-116及Vero细胞的细胞毒性与选择性指数（SI），通过伤口愈合实验评估抗侵袭活性，利用膜联蛋白V（Annexin V）-FITC/碘化丙啶（PI）及PI染色分别进行凋亡与细胞周期流式分析；应用Plackett–Burman设计与响应面法（RSM）优化营养条件以最大化产量；评估4 °C斜面保存稳定性及L. lontaroides提取物对产量的影响；最后通过SwissTargetPrediction、STRING数据库、Cytoscape构建蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络及AutoDock Vina进行Epothilone B与核心靶点及β-微管蛋白的分子对接分析。

Isolation of the fungal endophytes of L. lontaroides and their antifungal activity

研究人员从L. lontaroides叶片中分离出9株内生真菌，基于形态学初步鉴定为A. glaucus、A. fumigatus等。抗真菌活性引导实验显示A. glaucus乙酸乙酯（EA）提取物对A. flavus抑制圈直径最大（23.4 mm），MIC值为17.6 μg/mL，据此筛选出高活性菌株进行后续Epothilone筛查。

Screening for epothilone production and preliminary purification

基于抗真菌活性，选取A. glaucus等4株活性最高菌株筛查Epothilone生产。TLC显示在R_f值与authentic Epothilone B一致的位点有荧光斑点，HPLC证实A. glaucus提取物和标准品保留时间均为3.4 min。A. glaucus初始Epothilone产量达119.8 μg/L，纯化效率约85%。

Identification of the potent epothilone-producing fungi

综合形态学（灰绿至深绿色菌落、亚球形泡囊、单列瓶梗）与ITS序列分析（~650 bp，GenBank登录号OR342865.1，与A. glaucus相似性99.8%）确认高产菌株为A. glaucusEFBL-SR，系统发育聚于Clade II。

Chemical structure elucidation of epothilone extracted from A. glaucus

UV-Vis在λ₂₄₇nm有最大吸收；FT-IR显示3263 cm^?1（O–H）、1694 cm^?1（C=O）、1237 cm^?1（环氧环）等特征吸收；¹HNMR信号符合Epothilone B烷基质子及含氧甲基特征；LC/ESI–MS/MS测得质子化分子离子峰m/z 508.3及m/z 178.05、225.17等碎片离子，确证化合物为Epothilone B。

Cytotoxicity, anti-invasive activity, cell cycle, and apoptotic analysis of the purified A. glaucus epothilone

纯化Epothilone B对HepG-2、MCF-7、HCT-116的IC₅₀分别为0.028、0.034、0.13 μM，对Vero细胞为0.35 μM，选择性指数分别为12.5、10.3、2.7。伤口愈合实验显示处理72 h后MCF-7和HepG-2细胞伤口闭合率分别显著抑制35.0%和40.2%（p < 0.05）。流式细胞术显示HepG-2细胞在IC₅₀处理下G1期比例增至55.03%（对照41.66%）；总凋亡、早期凋亡、晚期凋亡分别增至32.28%、22.03%、8.06%，较对照提升约13.3、24.5、57.6倍。

Stability of epothilone productivity by A. glaucus with storage and effect of different L. lontaroides extracts

4 °C斜面保存下，Epothilone生产力随储存期下降，6个月和10个月产量分别降至49.41 μg/L和16.58 μg/L（初始119.8 μg/L），生物半衰期约5个月。添加L. lontaroides乙酸乙酯提取物可使第6个月菌种的产量部分恢复至70.42 μg/L（增幅1.4倍），二氯甲烷和乙醇提取物无明显作用。

Nutritional optimization of A. glaucus to maximizing its epothilone yield by the response surface methodology

Plackett–Burman设计筛选19种营养因素，确定麦芽糖、乳糖、酒石酸铵等为显著影响因子。优化后方程预测产量220.55 μg/L，实际最高达240.02 μg/L，较初始培养基（119.8 μg/L）提升约2倍。模型F值5.13，R²=0.78，具统计显著性。

Network pharmacological and molecular docking analyses of epothilone B

从DrugBank和SwissTargetPrediction获119个非冗余人类基因，DisGeNET筛选出86个癌症相关靶标。STRING构建PPI网络（74节点，285边，置信度>0.7），Cytoscape/CytoNCA拓扑分析经两层过滤确定8个核心枢纽基因：HSP90AA1、EGFR、PIK3CA、SRC、JAK2、HSP90AB1、MTOR、PIK3CG。分子对接显示Epothilone B与这些靶点及β-tubulin紫杉醇位点结合能介于-6.6至-9.3 kcal/mol，其中SRC结合最强（-9.3 kcal/mol），形成氢键、π-阴离子及疏水接触，证实其多靶点相互作用模式。

讨论部分总结

讨论指出Epothilones源于S. cellulosum但因生长慢、产量低受限，真菌尤其是A. glaucus提供了替代平台。本研究通过生物活性引导从L. lontaroides筛选出A. glaucus，其经RSM优化产量达240.02 μg/L，虽低于部分报道的S. cellulosum但真菌易于分子操作。化学结构经多谱学确证为Epothilone B。细胞实验显示高选择性细胞毒性和抗转移潜力，G1期阻滞可能与间接调控CDK、cyclin及EGFR/PI3K/SRC/JAK2/mTOR信号有关，不同于典型G2/M期阻滞，体现细胞环境依赖性。网络药理学揭示Epothilone B除微管稳定外，可作用于HSP90、EGFR、SRC等核心癌信号枢纽，分子对接验证了多靶点稳定结合。储存衰减及植物乙酸乙酯提取物部分恢复产量提示宿主-微生物化学信号互作重要性。A. glaucus不产生黄曲霉毒素等强毒性霉菌毒素，安全性相对可控，其Epothilone B兼具抗真菌与抗癌双重属性，对免疫低下癌症患者具药理前景。

结论翻译

综上所述，研究人员鉴定Latania lontaroides内生真菌A. glaucusOR342865.1是具生物活性Epothilone B的有前景来源。通过生物活性引导筛选及系统营养优化显著提升了Epothilone B产量，突显培养基组成在调节真菌次级代谢产物生物合成中的关键作用。全面化学表征确证了纯化化合物的结构身份，生物学评估显示其对测试细胞系相较之下具有显著改善的抗癌效力与选择性。此外，整合体外实验、网络药理学及分子对接分析支持一种双机制模型，即Epothilone B通过β-微管蛋白稳定发挥直接细胞毒性，同时调节涉及增殖、存活及转移行为的关键致癌信号枢纽。这些发现共同强化了内生真菌作为Epothilone B生产替代且经济可行平台的相关性，并支持进一步开发真菌源Epothilone B作为多功能抗癌剂。