MiR-4327靶向TP53促进宫颈癌细胞增殖

《Functional & Integrative Genomics》：MiR-4327 targets TP53 to promote cervical cancer cell proliferation

　　

宫颈癌（cervical cancer）是全球女性高发恶性肿瘤之一。尽管microRNA-4327（miR-4327）被认为是一种潜在的癌基因（oncogene），但其在宫颈癌发生发展中的作用及分子机制尚不清楚。本研究旨在明确miR-4327在宫颈癌中的致癌功能并阐明其下游调控机制。研究人员采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）检测宫颈癌临床组织及细胞系中miR-4327的表达水平；通过细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）、克隆形成实验、Transwell小室实验及流式细胞术评估miR-4327对细胞增殖、迁移、侵袭及细胞周期进程的影响；通过建立非肥胖型糖尿病（non-obese diabetic，NOD）-严重联合免疫缺陷（severe combined immune-deficient，scid）小鼠异种移植瘤模型评估体内成瘤能力；利用生物信息学分析及双荧光素酶报告基因实验鉴定TP53为miR-4327的直接靶基因，并通过过表达及敲低功能验证二者调控关系。结果显示，miR-4327在宫颈癌组织中显著上调，体外可促进宫颈癌细胞恶性表型（增殖、迁移、侵袭及细胞周期进展），体内过表达miR-4327可加速肿瘤生长。机制上证实TP53为miR-4327的直接功能靶基因——敲低TP53可模拟miR-4327的致癌效应，而恢复TP53表达则可逆转miR-4327介导的促肿瘤作用。上述发现揭示了新型miR-4327/TP53调控轴，并将miR-4327确立为宫颈癌干预的潜在治疗靶点。

论文解读：MiR-4327靶向TP53促进宫颈癌细胞增殖

本研究围绕宫颈癌（cervical cancer）分子发病机制中microRNA（miRNA，一类长约22 nt的非编码RNA，通过结合靶mRNA的3'非翻译区抑制翻译或促进降解从而调控基因表达）的作用展开。目前宫颈癌筛查手段仍存在误诊及漏诊风险，晚期及复发宫颈癌治疗效果有限，寻找新的诊断标志物及治疗靶点具有重要意义。已有研究表明miRNA异常表达与宫颈癌的发生、侵袭和转移密切相关，但miR-4327在宫颈癌中的具体功能及机制尚未见报道。为此，研究人员探究了miR-4327在宫颈癌中的表达模式、生物学功能及其通过靶向TP53（编码肿瘤抑制蛋白p53，通过调控G₁/S检查点、DNA修复及凋亡维持细胞稳态）发挥作用的分子机制，论文拟发表于《Functional & Integrative Genomics》。

主要关键技术方法：

研究人员收集2024年1—12月南方医科大学附属中西医结合医院5例接受手术治疗的宫颈癌患者癌组织及癌旁正常组织标本进行临床验证；采用人宫颈癌HeLa和SiHa细胞系进行体外功能与机制实验；通过miR-4327 mimics（模拟物）/inhibitor（抑制剂）转染及TP53过表达/敲低（siRNA）进行功能获得与缺失实验；利用qRT-PCR检测miR-4327及TP53 mRNA表达，CCK-8、5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶核苷（EdU）掺入实验、划痕愈合实验、Transwell迁移及侵袭实验、平板克隆形成实验及碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色流式细胞术分别检测细胞增殖、迁移、侵袭、克隆形成能力及细胞周期分布；蛋白质免疫印迹（Western blot，WB）检测N-钙黏蛋白（N-cadherin，Ncad）、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、细胞周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）及TP53蛋白水平；建立NOD-scid小鼠皮下异种移植瘤模型评估体内成瘤能力；通过转录组测序（RNA-seq）筛选差异表达基因并结合miRDB、miRwalk、TargetScan数据库预测miR-4327靶基因取交集，进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析；双荧光素酶报告基因实验验证miR-4327与TP53 3'UTR的直接结合；移植瘤组织行苏木精-伊红（hematoxylin and eosin，H&E）染色及免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）检测Ki-67和TP53蛋白表达；统计学分析采用Student's t检验或单因素方差分析（one-way ANOVA）及Tukey多重比较检验。

研究结果：

MiR-4327 is significantly upregulated in human cervical cancer tissues

研究人员对5对宫颈癌组织及配对的癌旁正常组织进行qRT-PCR检测，发现miR-4327在宫颈癌组织中表达显著升高；H&E染色显示癌组织细胞核异型性明显、核分裂象增多；IHC显示Ki-67阳性细胞比例在癌组织中显著高于正常及癌旁组织，提示miR-4327可能通过促进细胞增殖参与宫颈癌发生发展。

MiR-4327 promotes proliferation, migration, invasion and progression of cervical cancer cells and induces cell cycle transition

在HeLa和SiHa细胞中转染miR-4327 mimics使miR-4327过表达，CCK-8及EdU实验显示细胞增殖能力显著增强，反之转染miR-4327 inhibitor后增殖受抑；划痕实验显示miR-4327过表达加速伤口闭合，抑制则减缓；Transwell实验表明miR-4327过表达增加迁移及侵袭细胞数，抑制则减少；流式细胞术分析显示miR-4327过表达使G₁期细胞比例下降、S期比例相对增加，抑制miR-4327则G₁期细胞比例上升，表明miR-4327可促进宫颈癌细胞周期由G₁向S期过渡。

MiR-4327 increases the tumorigenicity of HeLa cells in the NOD scid mouse model

将转染miR-4327 mimics或inhibitor的HeLa细胞接种于NOD-scid小鼠右侧腋下，每3天测量肿瘤体积。结果显示miR-4327过表达组成瘤体积及最终瘤重均显著大于对照组（p＜0.0001及p＝0.0012），而miR-4327 inhibitor组与对照inhibitor NC组差异无统计学意义（p＝0.9903）；H&E染色示过表达组肿瘤细胞密集、异型性明显，抑制组可见较多凋亡坏死区，证实miR-4327可在体内增强宫颈癌细胞成瘤能力。

Pathway enrichment analysis and target gene prediction

对转染miR-4327 mimics的HeLa和SiHa细胞进行转录组测序，筛选|log₂FC|＞1的差异表达基因（共413个），与三个数据库预测的259个miR-4327潜在靶基因取交集后进行KEGG富集分析，显著富集于p53信号通路；候选基因为TP53。双荧光素酶报告实验显示共转染miR-4327 mimics与野生型TP53 3'UTR报告载体后荧光素酶活性显著降低，而突变型TP53 3'UTR组无变化，证明miR-4327直接靶向TP53的3'UTR抑制其表达。

Decreased expression of TP53 promotes proliferation of cervical cancer cells

qRT-PCR及IHC显示宫颈癌组织中TP53 mRNA及蛋白水平低于正常组织，miR-4327过表达移植瘤中TP53蛋白表达降低、抑制miR-4327则升高；体外敲低TP53使HeLa和SiHa细胞活力升高（模拟miR-4327过表达效应），过表达TP53抑制细胞活力；WB显示TP53敲低后Ncad、Cyclin D1、CDK4蛋白上调，过表达则下调，说明TP53受miR-4327负调控并在宫颈癌中起抑制增殖作用。

Overexpression of TP53 restores the inhibitory effect of miR-4327 on cervical cancer

共转染miR-4327 mimics与TP53过表达载体，CCK-8及克隆形成实验显示TP53过表达可抵消miR-4327过表达对细胞活力和克隆形成的促进作用；WB显示共转染组中Ncad、Cyclin D1、CDK4蛋白水平较单独TP53过表达组回升，证实TP53过表达可挽救miR-4327介导的促增殖效应，进一步支持miR-4327通过靶向抑制TP53发挥致癌作用。

讨论与结论：

研究人员在讨论中指出，本研究首次证实miR-4327在宫颈癌组织中高表达并具有致癌功能，可促进宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭及G₁/S期转换，并在体内加速肿瘤生长；机制上miR-4327直接结合TP53 mRNA的3'UTR抑制TP53表达，解除p53对细胞周期的抑制作用，上调Cyclin D1和CDK4并促进上皮–间质转化（epithelial–mesenchymal transition，EMT）相关分子Ncad表达，从而促进肿瘤进展。研究局限性包括仅使用HPV阳性HeLa和SiHa细胞系、临床样本量较小、异种移植模型临床相关性有限及miR-4327/TP53轴下游详细网络尚需进一步阐明。

结论（翻译）：

综上所述，本研究表明miR-4327在调控宫颈癌细胞增殖中发挥关键作用；此外，受miR-4327调控的靶基因TP53介导宫颈癌细胞周期的改变从而促进细胞增殖。这些发现为理解宫颈癌增殖的分子机制提供了新见解，并为该疾病的精准治疗策略提供了潜在方向。