单核细胞增生李斯特菌与人体脉络丛内皮细胞的体外相互作用：对上皮细胞侵袭的影响

《Human Cell》：Interaction of Listeria monocytogenes with the human choroid plexus endothelium in vitro: impact on invasion of the epithelium

　　

在中央神经系统（CNS）中，高度血管化的脉络丛（CP）产生脑脊液（CSF），并充当血-脑脊液屏障（BCSFB）。由于位于脑室系统，CP可被细菌等病原体用于通过从血液进入大脑而进入CNS。这一过程可导致脑膜炎、脑炎和脑膜脑炎，通常由BCSFB阻止。由于屏障功能被认为主要由CP上皮细胞执行，这些细胞通过紧密连接（TJ）相互连接，因此对与BCSFB相互作用的细菌病原体的体外研究通常仅使用CP上皮细胞。最近的数据表明，CP内皮细胞也可能对BCSFB的屏障功能有所贡献。在本研究中，研究人员使用永生化人CP内皮细胞（iHCPEnC）来研究CP内皮细胞与细菌病原体单核细胞增生李斯特菌（Lm）的相互作用。尽管Lm黏附于iHCPEnC，但内皮细胞仅被Lm弱侵袭，但容易被跨细胞迁移，这与CP上皮细胞系（HIBCPP细胞）形成对比。在CP的双细胞类型模型中，Lm跨过iHCPEnC迁移并侵入HIBCPP细胞，表明CP内皮细胞在Lm试图克服BCSFB时并不构成特别强的屏障。与仅由HIBCPP细胞组成的模型相比，上皮细胞侵袭减少，提示CP内皮细胞具有调节作用。

论文解读文章

**研究背景**
脉络丛（CP）位于脑室系统，由多种细胞类型构成，包括有窗孔的内皮细胞和通过紧密连接（TJ）连接的上皮细胞。上皮细胞形成血-脑脊液屏障（BCSFB）的主要屏障，而内皮细胞通常被认为较“漏”。既往体外研究多聚焦于CP上皮细胞（如HIBCPP细胞）与病原体的相互作用，但新近证据表明CP内皮细胞亦可能参与屏障功能。单核细胞增生李斯特菌（Lm）是一种食源性胞内病原体，可穿越肠道屏障入血，进而侵袭血脑屏障（BBB）或BCSFB，引发脑膜炎或脑膜脑炎。Lm借助内化素（Inl）如InlA、InlB和InlF分别与宿主细胞表面受体E-钙黏蛋白（E-Cadherin）、受体酪氨酸激酶Met（Met）和波形蛋白（Vimentin）结合以实现侵袭。然而，CP内皮细胞对Lm穿越BCSFB的具体作用尚不明确，且缺乏整合内皮与上皮成分的体外模型。为此，研究人员利用永生化人CP内皮细胞（iHCPEnC）与HIBCPP上皮细胞，构建单细胞及双细胞模型，系统探究Lm与CP内皮细胞的相互作用及其对上皮侵袭的影响。该研究发表于《Human Cell》。

**主要技术方法**
研究人员采用RT-PCR和Western blot检测iHCPEnC、HIBCPP、人脑微血管内皮细胞（HBMEC）及hCMEC/D3中Lm表面受体相关基因（CDH1、Met、Vimentin、CDH5）的转录与蛋白表达。通过双免疫荧光染色区分黏附与侵袭的Lm，计数并计算百分率。跨细胞迁移实验使用Transwell小室（3 μm孔径），分别比较Lm穿过iHCPEnC、HIBCPP及无细胞滤膜的菌落形成单位（CFU）。双细胞共培养模型将HIBCPP倒置接种于滤膜下室，待跨上皮电阻（TEER）达标后，于上室接种iHCPEnC。Lm菌株为EGDe及其ΔInlF突变株，感染复数（MOI）为10。所有实验至少重复3次，数据采用线性混合效应模型进行统计分析。

**研究结果**

**1. iHCPEnC表面Lm受体的表达**
通过RT-PCR发现，iHCPEnC表达Met和Vimentin的mRNA，但不表达CDH1（E-Cadherin），而HIBCPP细胞则表达CDH1和Met；内皮标志物CDH5（VE-Cadherin）仅在iHCPEnC和hCMEC/D3中检测到。Western blot证实蛋白水平与RNA表达一致，HBMEC中CDH5表达极低。该结果说明iHCPEnC缺乏E-Cadherin，但具备InlB和InlF的潜在靶点。

**2. Lm EGDe跨iHCPEnC与HIBCPP的迁移**
跨细胞迁移实验显示，HIBCPP细胞在4–6小时后TEER显著下降，表明Lm破坏其屏障功能；而iHCPEnC本身不形成高TEER，对Lm跨细胞迁移无抑制，细菌通过率与空滤膜无显著差异。相比之下，HIBCPP细胞显著减少Lm穿越（p<0.001）。这表明CP内皮细胞不构成Lm穿越BCSFB的强物理屏障。

**3. iHCPEnC感染Lm**
iHCPEnC被Lm EGDe感染4小时后，黏附率约为0.84%，而侵袭率仅0.03%。ΔInlF突变株的黏附与侵袭率与野生型EGDe相当，无显著差异。说明InlF-Vimentin途径在iHCPEnC侵袭中作用不显著，而InlB-Met可能为主导机制。

**4. 双细胞类型共培养系统感染Lm**
在共培养模型中，Lm对iHCPEnC的侵袭率与单层培养相似，但对HIBCPP细胞的侵袭率显著低于仅HIBCPP单层培养（p<0.01）。TEER在实验期间保持稳定。该结果提示CP内皮细胞可能通过调节性机制（如增强屏障功能或改变上皮细胞表面受体表达）间接减少Lm对上皮的侵袭。

**总结与讨论**
研究人员指出，iHCPEnC缺乏E-Cadherin是导致其低侵袭率的主要原因，而InlB-Met相互作用可能介导了有限的侵袭。尽管InlF-Vimentin曾被报道参与脑定植，但本研究未观察到ΔInlF突变株侵袭力改变，与之前HBMEC研究一致，需进一步探究。在双细胞模型中，内皮细胞虽不直接阻止Lm跨细胞迁移，但显著降低了Lm对上皮的侵袭，这可能与共培养系统增强的屏障功能（TEER升高）或内皮细胞对上皮细胞表面受体（如E-Cadherin、Met）表达的调控有关。具体分子机制仍需深入探索。

**研究结论翻译**
研究人员得出结论：Lm可黏附于iHCPEnC并弱侵袭，但易跨内皮迁移；在双细胞模型中，Lm跨过内皮细胞后侵袭上皮细胞，但侵袭率低于仅上皮细胞模型，提示CP内皮细胞对Lm穿越BCSFB不构成强屏障，但通过调节作用影响上皮侵袭。该机制可能涉及细胞黏附分子调控或受体表达变化，最终减少细菌感染CNS的机会。