1型糖尿病中年龄无关免疫亚型呈现不同的发病后进展速率及免疫治疗反应

《Diabetologia》：Age-independent immune subtypes in type 1 diabetes exhibit distinct post-onset progression rates and immunotherapeutic responses

　　

目的：改进1型糖尿病（type 1 diabetes, T1D）的预防与治疗策略需深入理解其异质性。研究人员旨在利用血浆诱导转录（plasma-induced transcription）、生物信息学工具及靶向随访分析，测量新发T1D受试者中的免疫学异质性。方法：分析来自六项免疫治疗试验中560名受试者的干预前样本，采用血浆诱导转录生物测定法及标准化报告细胞群。结果：基线转录组学分析鉴定出2854个至少在五项试验中存在高变异性的转录本。无监督聚类将受试者分为两个亚组，两组平均年龄无差异，且分组在基线后纵向样本中保持稳定（p=1.4×10?14），提示分组不受短暂性复发—缓解免疫活动驱动。表型分析及独立新发T1D队列发现，亚组1富集中性或低风险HLA单倍型携带者及C肽下降速率最快的最年轻受试者（p<0.05）；该亚组血浆细胞因子与趋化因子水平升高，循环CD4+CXCR3+CCR6?Th1 T细胞增多（p<0.05），且对抗CD20治疗反应更佳。亚组2富集胰岛素自身抗体阳性者、血浆miR-155-5p和miR-409-3p水平较高者（p<0.05），对CTLA4-Ig治疗反应更佳，该反应与CD4+CD45RO+CD62L+中央记忆T细胞更大幅度减少（p=8.1×10?5）及调节性T细胞（Treg）保留（p=0.02）相关。结论：上述发现支持存在免疫学上 distinct 的T1D亚组，并为未来靶向治疗干预提供了可能性。

论文解读：1型糖尿病中新发患者年龄无关免疫亚型的分型、进展差异及免疫治疗响应

《Diabetologia》发表的本研究针对1型糖尿病（type 1 diabetes, T1D）是一种由自身免疫介导的胰岛β细胞破坏所致疾病，现有免疫治疗效果短暂且个体差异大，公认其存在临床与免疫学异质性，既往提出的T1DE1/T1DE2内型（endotype）与发病年龄密切相关，但缺乏不依赖年龄、基于功能性免疫状态的亚型划分框架。研究人员假设新发T1D患者血浆诱导外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）的转录特征可反映潜在免疫异质性，并与β细胞功能衰退及免疫治疗响应相关联，因此利用多中心临床试验样本开展无监督分型验证。

主要关键技术方法

研究使用两大样本队列：发现队列为Type 1 Diabetes TrialNet六项为新发T1D设计的免疫治疗试验（抗CD20/利妥昔单抗NCT00279305、CTLA4-Ig/阿巴西普NCT00505375、MMF-DZB NCT00100178、GAD疫苗NCT00529399、抗IL-1β/卡那奴单抗NCT00947427、ATG-GCSF NCT02215200）中共560例诊断100天内、≥1种胰岛自身抗体阳性、刺激C肽≥0.2 nmol/l的受试者基线（及部分3–6月）血浆；验证队列为威斯康星儿童医院61例新发T1D局部队列。核心技术含：血浆与冻存标准PBMC共培养后全基因组 microarray 检测血浆诱导转录本，加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis, WGCNA）筛选高变异转录本并做无监督层次聚类（hierarchical clustering, HCL）与PCA/tSNE分型；独立队列用K Top Scoring Pairs（KTSP）分类器验证；Luminex 71-plex检测血浆细胞因子/趋化因子；RT-qPCR检测血浆microRNA（miRNA）；谱流式细胞术（spectral flow cytometry）分析T细胞亚群（Th1/Th2/Th17/Tfh/Treg、中央记忆T细胞）；混合效应模型（linear mixed-effect model, LMM）与ANCOVA评估C肽下降速率（rate of decline, ROD）及免疫治疗分组交互效应。

研究结果

Association of variation in plasma-induced transcription with beta cell function

研究人员对406名<18岁受试者WGCNA构建8个转录模块，模块与β细胞表型（2 h C肽曲线下面积AUC、C肽ROD等）相关性在有效治疗组（抗CD20、CTLA4-Ig、TG-GCSF）安慰剂臂多于治疗臂，提示免疫干预减弱了疾病相关活动；无效治疗试验也存在此趋势。证实筛选出的2854个高变异探针集可反映T1D疾病相关免疫活动。

Unsupervised clustering reveals age-independent subgroups

对全队列（儿童n=406，成人n=154）2854探针集做HCL与PCA均将受试者稳定分为亚组1（Subgroup 1, SG1, n=291）与亚组2（SG2, n=269），两组成年与儿童平均无差异；纵向3–6月安慰剂样本再分类准确率73.6%（AUC=0.82, p=1.4×10^?14），证明分型非短暂免疫波动所致。按<7岁、7–13岁、>13–18岁、≥18岁分层仍各自分出两亚组，表明分型跨年龄存在；SG1中<7岁个体基线C肽AUC最低、C肽ROD最快。

Canonical pathway and upstream regulator analysis reveals proinflammatory and immunoregulatory divergence across subgroups

IPA（Ingenuity Pathway Analysis）通路富集显示SG1上调TNF、IFN-γ、LPS预测上游调控子及Th1相关转录本（CCR1、CCR5、HAVCR2、T-bet/TBX21依赖），SG2上调Th17相关转录本（IL21R、IL23A、BATF、RORc/STAT3依赖）及miR-155-5p宿主基因MIR155HG。取年龄无关的差异表达探针（1082个）做上游调控分析，预测SG1先天免疫受体活化、SG2部分miRNA抑制模式，证实两亚组具不同免疫偏移方向。

Phenotypic characteristics of subgroups 1 and 2

全队列两亚组性别、BMI、青春期分期、平均年龄无差异；SG2胰岛素自身抗体（IAA）阳性比例偏高（p_adj=0.08），SG1中性/低风险HLA单倍型比例偏高（p_adj=0.09）；安慰剂组中SG1更快C肽ROD（≤?0.15/月）者占比更高（p_adj=0.09）。儿童亚组中SG1 <14岁者及快速C肽衰退者富集更显著（p_adj=0.05–0.06）。

Validation of plasma-induced transcriptional signatures in a local cohort

局部队列n=61经同样2854探针集HCL再分为两亚组，KTSP模型分类准确率83.1%（AUC=0.96, p=3.02×10^?9），验证分型可重复；但因样本量小未重现HLA/自身抗体表型差异。

Subgroup 1 exhibits elevated plasma cytokine/chemokine profiles

局部队列71-plex蛋白检测显示SG1多种炎症与调节性介质（IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-10、CCL7等）均值高于SG2，方向与转录预测一致，但单个因子未通过多重较正，提示需组合判别。

Subgroup 2 exhibits elevated plasma miRNA profiles

RT-qPCR显示SG2血浆miR-155-5p（4.13倍, p_adj=0.028）与miR-409-3p（2.11倍, p_adj=0.053）显著高于SG1；其已知靶基因在SG2血浆诱导转录中低表达，符合miRNA介导mRNA降解机制。

Plasma SCFA profiles

短链脂肪酸（short-chain fatty acid, SCFA）中仅乙酸酯在SG1轻度升高（p_adj=0.098），其余（丙酸、丁酸等）无组间差异。

Subgroup 1 exhibits increased Th1 CD4⁺T cell abundance

流式显示SG1循环CD4⁺CXCR3⁺CCR6^?Th1细胞占CD4⁺T细胞比例高于SG2（3.82% vs 2.33%, p=0.046），Th1/Treg比值更高（p=0.018）；B细胞、单核、CD8⁺、Th2、Th17、Tfh、Treg频率无组间差异。

Subgroups 1 and 2 differentially respond to immunotherapy

抗CD20（利妥昔单抗）治疗臂中SG1 C肽AUC高于同组安慰剂（meta p=0.002），延迟达C肽等效降幅时间为11.2月（SG2仅5.41月且无治疗vs安慰剂差异），提示SG1对B细胞清除疗法响应更好。CTLA4-Ig（阿巴西普）治疗臂中SG2 C肽AUC高于同组安慰剂（meta p=3.0×10^?4），延迟降幅时间8.70月（SG1为5.76月且无治疗vs安慰剂差异）；流式显示SG2经CTLA4-Ig后CD4⁺CD45RO⁺CD62L⁺中央记忆T细胞缩减更显著（24.3%, p=8.1×10^?5vs SG1中11.9%），Treg丢失较少（33.6% vs SG1中40.8%），且中央记忆T细胞变化与SG2中C肽保存相关（p=0.0057）。TG-GCSF两亚组均显示治疗臂C肽ROD低于安慰剂但无组间C肽AUC差异。无效试验（MMF-DZB、GAD Vx、抗IL-1β）未见亚组特异响应。

讨论与结论翻译

本研究提出一种不依赖于发病年龄的T1D免疫亚型划分框架，经多中心大样本验证且纵向稳定。SG1偏向Th1/先天炎症、富集低危HLA及快速β细胞衰退年轻患者，对B细胞靶向抗CD20响应较好；SG2偏向Th17/miRNA调控、富集胰岛素自身抗体及miR-155-5p/miR-409-3p升高，对共刺激阻断CTLA4-Ig响应较好且伴随中央记忆T细胞更明显缩减与Treg较好保留。两亚型在未成年与成年患者中均可辨识，部分转录具年龄依赖性但与分型正交。研究局限含横断面设计限制因果推断、单项试验内亚组样本量限制统计效能，需前瞻验证。结论：这些发现支持新发T1D存在免疫学上不同的亚型（immune subtypes），并为未来个体化（precision medicine）免疫治疗干预提供了依据。