综述：CD4+ T细胞对百日咳鲍特菌的免疫

《Discover Immunity》：CD4+?T-cell immunity to Bordetella pertussis

　　

尽管广泛免疫，百日咳鲍特菌（B. pertussis）病例在全球范围内再次激增，促使研究人员重新关注理解保护性免疫的关键机制。类似于自然感染，全细胞百日咳疫苗（wPV）免疫可产生持久的TH1/TH17 CD4⁺ T细胞应答，从而抵御B. pertussis感染。此外，wPV免疫可产生强大的组织驻留记忆T细胞（TRM）应答，限制百日咳疾病和传播。相反，无细胞百日咳疫苗（aPV）产生短暂的TH2极化免疫应答，可预防严重疾病，但无法阻止B. pertussis定植或传播。此外，表达aPV抗原变异的临床菌株的流行也凸显了对下一代百日咳疫苗的需求。因此，在感染部位协调先天性和适应性免疫应答，对于有效抵御B. pertussis定植和持续存在至关重要。本综述整合了研究人员当前从动物模型和人类研究中获得的关于自然免疫和疫苗介导的T细胞免疫的知识，以指导开发能够应对百日咳复燃的改良百日咳疫苗。

**2 CD4⁺ T细胞由B. pertussis感染和免疫产生的应答**
自然感染诱导的CD4⁺ T辅助细胞应答极化为TH1和TH17表型。TH1分化部分由气道巨噬细胞产生的IL-12驱动，该细胞在感染早期对细菌脂多糖（LPS）的反应中被激活。IL-12还刺激IFNγ的产生，尤其是来自自然杀伤（NK）细胞，进一步强化TH1极化。在小鼠模型中，感染后第7天CD4⁺ T细胞被募集至肺部。TH1细胞产生的IFNγ使小鼠气道巨噬细胞极化为M1/经典状态，通过一氧化氮依赖和非依赖机制杀灭B. pertussis。气道巨噬细胞的耗竭增加肺部菌载量，突显其保护作用。同时，B. pertussis可通过释放百日咳毒素（PT）和腺苷酸环化酶毒素（ACT）主动调节巨噬细胞功能，通过未明确的抑制机制改变巨噬细胞促炎基因表达。IFNγ还刺激呼吸道上皮细胞产生趋化因子CXCL9和CXCL10，募集白细胞至感染部位。IFNγ是肺部有效清除B. pertussis的必要条件，IFNγ依赖性信号通路在预防细菌播散和严重百日咳疾病中起关键作用。此外，TH1细胞应答对百日咳持久免疫至关重要，因为IFNγ缺陷小鼠在B. pertussis攻击后菌载量高于野生型小鼠。
TH17介导的免疫应答在黏膜屏障部位的病原体清除中发挥关键作用。B. pertussis感染募集产生IL-17的T细胞至鼻腔，IL-17诱导的应答对于清除鼻腔B. pertussis感染至关重要。B. pertussis成分如脂寡糖（LOS）、ACT和PT诱导先天免疫细胞（如树突状细胞和巨噬细胞）产生TH17极化细胞因子IL-1β、IL-6、IL-21和IL-23。小鼠和狒狒研究显示，B. pertussis感染在鼻咽部诱导IL-6、IL-1β和IL-23。缺乏IL-6或IL-1β的小鼠表现出B. pertussis清除受损，强调这些TH17极化细胞因子在感染中的保护作用。IL-17缺失阻止B. pertussis从鼻腔清除，表明IL-17介导的免疫在控制上呼吸道B. pertussis定植中的重要性。TH17细胞促进鼻咽部细胞中效应趋化因子CXCL1和CXCL2以及GCSF、IL-8、MCP-1和MIP-1α的上调，导致单核细胞和中性粒细胞的募集。Siglec-F⁺中性粒细胞在鼻腔中富集，并表现效应功能，包括中性粒细胞胞外陷阱（NET）形成、活性氧产生和吞噬作用。与保护作用一致，中性粒细胞耗竭损害恢复期小鼠中B. pertussis的清除。B. pertussis毒力因子如PT和ACT通过积累细胞内cAMP、抑制氧化爆发、阻止NET形成和吞噬作用来对抗中性粒细胞活性。TH17分化的重要性也在狒狒研究中得到证实，用热灭活B. pertussis刺激狒狒PBMC诱导IL-6、IL-23和IL-1β，表明这些细胞因子是该大型动物模型中与TH17分化相关的先天免疫应答的关键驱动因素。
IL-17诱导免疫细胞和上皮细胞在黏膜中产生关键保护机制，包括抗菌肽如防御素和导管素，发挥杀菌作用。人类和动物模型研究显示，B. pertussis感染上调LL-37和β-防御素水平，参与对B. pertussis的抗菌活性。B. pertussis感染后，上皮细胞黏蛋白基因MUC2和MUC5AC表达增加。B. pertussis的铁剥夺增强细菌黏蛋白结合，使细菌细胞对黏蛋白抑制更敏感。

**2.1 呼吸道黏膜中的T细胞应答**
虽然全身性和黏膜CD4⁺ T细胞应答均有助于从呼吸道清除B. pertussis感染，但越来越多的证据表明组织驻留记忆T（TRM）细胞在持久保护中至关重要。小鼠模型对定义组织驻留CD4⁺ T细胞的重要性至关重要。TRM是自然感染产生的长寿命细胞，驻留在组织中，不通过血液循环。它们在呼吸道中的存在提供了对再感染的快速应答，是抵御病原体的关键第一道防线。在小鼠模型中，感染后1-2周即可在肺部检测到CD4⁺ TRM，并在细菌载量清除后继续定植于肺和鼻。人类研究显示，肺部TRM群体通过循环T细胞的播种在整个衰老过程中得到补充和维持，强调这一一线记忆应答的重要性。肺部CD4⁺ TRM主要产生IFNγ；同时，鼻中CD4⁺ TRM发育并主要产生IL-17。在细菌攻击从呼吸道清除后长达七个月仍可在鼻和肺中检测到TRM。再感染后，TRM细胞迅速局部扩增，对于降低肺和鼻的B. pertussis载量至关重要。TRM的重要性通过用鞘氨醇-1-磷酸受体拮抗剂FTY720处理恢复期小鼠后再攻击得到证明。FTY720将循环细胞保留在淋巴结中，阻止其定位至感染部位。FTY720处理的小鼠显示黏膜TRM细胞扩增并降低肺部B. pertussis细菌载量，表明仅组织驻留免疫细胞即可清除细菌。此外，从恢复期小鼠将TRM细胞过继转移至未受照射的幼稚小鼠，降低受体攻击小鼠的B. pertussis载量。
wPV由甲醛化学灭活的B. pertussis与白喉和破伤风类毒素结合组成。肌肉注射wPV诱导TH1/TH17极化的全身免疫应答，在B. pertussis攻击后被吸引至呼吸道黏膜。肺中建立CD4⁺IFNγ TRM细胞，鼻中建立CD4⁺IL-17⁺ TRM细胞。这些TRM对于降低呼吸道B. pertussis载量至关重要，并提供强大快速的再感染保护。重要的是，与自然感染一样，wPV免疫小鼠鼻中B. pertussis细菌载量降至检测限以下。此外，狒狒模型研究显示，wPV免疫动物不会传播感染。
与wPV相反，aPV免疫诱导强大的系统性TH2 T细胞应答。TH2分化由IL-4驱动，并促使T细胞产生IL-4、IL-5和IL-13。IL-4还促进B细胞中的IgG类别转换。虽然wPV和aPV均产生强IgG应答，但研究显示，接种无细胞明矾吸附百日咳类毒素的儿童主要产生针对PT的IgG1和IgG4，而自然感染和wPV免疫诱导IgG1和IgG3。尽管aPV促进抗体介导的免疫，但非人灵长类和人类研究显示，与wPV免疫相比，抗体滴度和保护性免疫下降更快。一个潜在解释是接种后滤泡辅助T细胞（TFH）应答产生和维持的差异。wPV免疫小鼠比aPV免疫小鼠产生更多TFH和更高水平CXCL13，并在淋巴结中持续更久，从而支持B细胞募至滤泡。相反，aPV免疫产生强大的抗B. pertussis、抗FHA和抗PT IgG抗体，在加强免疫后532天仍保持升高，但aPV免疫小鼠淋巴结中TFH群体在免疫后60天急剧减少。人类研究显示，wPV免疫诱导的T细胞应答比aPV免疫更持久。需要进一步的人类研究来严格评估接种后CD4⁺ TRM细胞的长寿性和效应功能。还需要额外研究确定CD4⁺ T细胞应答的强度、特异性和长寿性是否可作为百日咳保护的相关指标。

**2.2 B. pertussis感染和疫苗诱导的T_REG细胞**
T细胞效应功能可能被淋巴结和组织中的调节性T细胞（T_REG）减毒。aPV免疫诱导产生IL-10、IFNγ和IL-5的抗原特异性CD4⁺ T_REG细胞，并抑制TH17细胞产生IL-17。这些CD4⁺ T_REG细胞表达转录因子Foxp3和标志物CD49b、PD-1和Lag3。此外，aPV免疫还诱导表达IL-10的CD8⁺ T_REG细胞，抑制TH1和TH17 T细胞的活化。aPV免疫后阻断IL-10导致表达IL-17的CD4⁺ TRM增加。这些结果表明，aPV产生的免疫应答是次优的且远不持久，可能是aPV无法阻止鼻腔B. pertussis定植的根本原因。

**3 改善百日咳疫苗的新兴策略**
针对百日咳复燃，当前研究致力于创建改良的百日咳疫苗，保留现有aPV的安全性并克服其局限性。最佳疫苗配方应预防疾病并减少上呼吸道B. pertussis定植。活跃的研究领域包括新型疫苗抗原的鉴定、诱导TH1/TH17极化应答的新型佐剂以及产生组织驻留记忆T细胞应答的免疫途径。

**3.1 抗原发现与菌株变异**
当前工作集中于通过选择在不同临床分离株中高度保守且不易受抗原调变的抗原来改进aPV的抗原组成。在使用aPV的国家中，Prn缺陷菌株的流行持续增加。这些菌株也在仍以wPV免疫为标准治疗的国家中被分离出来。因此，包含保守疫苗抗原可能防止抗原调变，从而改善疫苗介导的保护。通过动物模型和人类中的全基因组筛选方法探索了新型抗原的鉴定。非人灵长类模型中的Tnseq筛选鉴定了在体外和体内对B. pertussis生存均具有免疫原性和必要性的抗原。全基因组映射B. pertussis特异性CD4⁺ T细胞应答，鉴定了多个被wPV免疫者T细胞识别的新型疫苗抗原。该研究还显示，aPV免疫者的T细胞对某些新型抗原有反应，表明这些个体可能曾暴露于B. pertussis。这些发现提示无症状感染有助于塑造T细胞应答。数据还表明，wPV免疫个体可能对疫苗接种和后续感染中遇到的抗原产生比aPV免疫个体更强的应答。另一项研究中，计算机预测鉴定了被wPV免疫者记忆T细胞识别的潜在疫苗抗原。反向疫苗学方法也鉴定了潜在的B. pertussis疫苗候选物。这些研究表明B. pertussis向免疫系统呈现大量潜在抗原。在下一代疫苗中包含这些抗原可能改善对流行分离株的保护，从而减少B. pertussis传播。

**3.2 新型佐剂与黏膜递送策略**
能够引发黏膜体液和细胞应答的佐剂将是新型亚单位疫苗的关键组成部分。当前努力集中于开发能将免疫应答极化为所需TH1和TH17表型的佐剂。例如，使用TLR2激动剂脂蛋白LP1569作为佐剂的无细胞配方诱导TH1/TH17介导的免疫应答，降低下呼吸道B. pertussis载量。包含TH1/TH17极化佐剂的配方正通过能在感染部位产生免疫应答的免疫途径进行测试。研究人员证明，在已批准aPV中添加TLR4激动剂Bordetella定植因子A（BcfA）可在肺和鼻腔中降低B. pertussis载量，与单独aPV相比。该疫苗通过肌肉注射初免后进行鼻内加强接种。细菌载量降低与上下呼吸道中TH1/TH17 CD4⁺ TRM细胞增加以及TH2应答总体下降相关。TLR9激动剂CpG ODN与明矾和aPV疫苗抗原联合引发TH1免疫应答并降低肺部B. pertussis载量。含有aPV抗原FHA、PT和Prn并用LP1569和STING激动剂c-d-GMP佐剂的疫苗，经鼻内递送，降低了肺和鼻的细菌载量。鼻内免疫含有佐剂curdlan的已批准aPV疫苗降低了小鼠呼吸道B. pertussis载量。aPV抗原与基于OMV的佐剂T-vant联合经鼻内递送，产生TH1/TH17极化的免疫应答，并清除肺和鼻咽部的B. pertussis载量。含有LP-GMP作为佐剂以及抗原PRN、FHA和PT的实验性无细胞百日咳疫苗经鼻内递送，在鼻中产生效应TH17应答，并在攻击后降低B. pertussis载量。这些研究共同表明，能够在全身和黏膜中产生TH1/TH17极化免疫应答的无细胞疫苗配方可能引发持久免疫应答，改善细菌清除。黏膜免疫策略为抗原和佐剂的局部递送提供了平台，从而增强感染部位的保护性免疫应答。这些策略将共同产生持久的组织驻留免疫和整个呼吸道的保护。

**3.3 下一代全细胞疫苗**
正在努力创建一种能提供持久保护且无反应原性的全细胞疫苗。减毒活百日咳疫苗BPZE1已被证明能引发与参考wPV高度相似的免疫应答。鼻内BPZE1免疫诱导强大的抗体滴度和TH1/TH17极化的细胞免疫应答。在小鼠中，免疫后一年仍观察到保护，表明免疫持续时间的增加。这一观察在狒狒研究中得到加强，显示鼻内递送BPZE1减少鼻腔定植，突显黏膜疫苗递送的重要性。该疫苗是安全的，正在进行的临床试验正在评估这种下一代疫苗的免疫应答和保护效力。

**4 总结与结论**
总之，这些研究强调了超越传统aPV疫苗配方、向引发持久黏膜免疫特别是长期TH1/TH17 TRM应答的新策略迈进的需求。保守抗原、TH1/TH17驱动佐剂和黏膜免疫递送策略的结合为未来百日咳疫苗奠定了基础，以解决当前aPV的局限性。这些疫苗必须安全并预防严重疾病，最重要的是减少鼻腔定植和传播可能性。此类疫苗将为各年龄段个体提供保护。用aPV免疫孕妇可在婴儿接种前保护新生儿，改良的母源疫苗将增加对这一脆弱人群的保护。实验性百日咳疫苗主要在鼠模型中进行测试，因为狒狒研究的高成本排除了在此大型动物模型中测试所有疫苗的可能。随着体外和离体模型的开发以重现和预测人类对疫苗和感染的应答，在这些系统中验证鼠研究将进一步加速预防B. pertussis持续存在和传播的下一代疫苗的开发。除了免疫原性，几个关键考虑因素影响鼻内疫苗的开发和部署，包括黏膜递送后安全性的严格评估、新型配方大规模生产和分配的可行性和成本效益，以及与黏膜亚单位疫苗批准相关的监管挑战。