一个有害的NFKB2错义变异与低丙种球蛋白血症相关

《Journal of Clinical Immunology》：A Detrimental NFKB2 Missense Variant is Associated with Hypogammaglobulinemia

　　

NFKB2编码前体p100，p100经过加工产生成熟的NF-κB2转录因子亚基p52。大多数已知的致病性NFKB2变异导致p100无法加工，通常与抗体缺陷、感染易感性及自身免疫相关的免疫缺陷病相关。研究人员描述了一个与抗体缺陷和反复呼吸道感染相关的杂合生殖系NFKB2错义变异（c.781C>T; R261W），在一个不完全外显率的德国家系中。患者来源的细胞p52水平降低，表明蛋白质不足是主要缺陷。体外通过HEK293T细胞中过表达EGFP融合的野生型和突变型p100/p52对R261W变异的表征显示，突变型p100水平受限，表明蛋白质表达不可持续，而突变型p52的维持几乎被排除，证实了有害的蛋白质缺陷。由组成型活性NF-κB诱导激酶（NIK）驱动的强制性p100加工导致突变型EGFP-p52的亚核聚集，而DNA结合活性检测不到。虽然异位过表达的EGFP-p52-R261W也形成核内聚集——这是之前确立的蛋白质衰变NFKB1突变的诊断指标——但其DNA结合能力并未丧失。总之，p100/p52 N端Rel同源结构域中的单氨基酸替换R261W导致蛋白质丢失，特别是成熟亚基p52的丢失。这种遗传状况与一种具有轻度临床症状的可遗传形式的低丙种球蛋白血症相关。因此，研究人员建议在患有反复呼吸道感染的轻度受影响患者中进行NFKB2表达缺失变异的基因筛查。

#### 论文解读文章

**研究背景**

原发性抗体缺陷（PAD）是一组先天性抗体生成障碍，范围从特异性抗体缺陷到选择性免疫球蛋白缺乏，严重形式如常见变异型免疫缺陷（CVID）表现为IgG、IgA和/或IgM水平降低，或无丙种球蛋白血症。虽然CVID的单基因病因已被部分阐明，但较轻形式抗体缺陷的单基因病因仍不清楚。NF-κB（核因子kappa-light-chain-enhancer of activated B细胞）信号通路在免疫调控中至关重要，其中NFKB1和NFKB2编码的蛋白分别参与经典和非经典通路。NFKB2编码前体p100，经蛋白酶体加工为成熟转录因子亚基p52，其C端Ankyrin重复结构域（ANK）发挥IκB样抑制作用。已知大多数致病性NFKB2变异影响p100的C端磷酸化/泛素化结构域（degron），导致p100不可加工，从而引起p52缺乏和IκB样活性增强，与早发性免疫缺陷、抗体缺陷及自身免疫相关。然而，针对NFKB2中Rel同源结构域（RHD）内的错义变异是否导致蛋白缺陷，此前尚无表征。本研究通过一个德国家系中发现的杂合NFKB2错义变异（c.781C>T; R261W），揭示其与低丙种球蛋白血症及反复呼吸道感染相关，且呈现不完全外显率，旨在阐明该变异导致的蛋白损伤机制，为轻度抗体缺陷患者的基因检测提供依据。该论文发表在《Journal of Clinical Immunology》。

**主要关键技术方法**

研究人员采用靶向外显子组测序（WES）和Sanger测序鉴定一个德国家系（包含先证者II-1、其父亲I-1、两名女儿III-1和III-2）中的NFKB2错义变异。用于功能分析的样本包括患者来源的EBV转化淋巴母细胞系和原代PBMCs。核心技术方法包括：（1）在HEK293T细胞中过表达EGFP融合的野生型或突变型p100/p52，结合荧光显微镜观察亚细胞定位；（2）共表达组成型活性NF-κB诱导激酶（GOF-NIK）以强制p100加工，分析p52核内分布；（3）Western blot检测蛋白质表达水平；（4）电泳迁移率变动分析（EMSA）检测DNA结合活性；（5）流式细胞术分析患者及健康对照的B细胞对BAFF或抗IgM刺激的反应。所有实验均与健康供者对照比较。

**研究结果**

**1. Case Report: German Family with Unspecified Antibody Deficiency（病例报告）**
通过临床评估和基因测序，先证者（II-1，女性）自幼患反复扁桃体炎和鼻窦炎，15岁时发现IgG降低（5.9 g/L），成年后IgM亦降低，但无严重感染或自身免疫。其父亲（I-1）无症状但免疫表型显示记忆B细胞和早期效应CD8⁺T细胞减少、多糖疫苗反应受损。先证者的长女（III-1）携带相同变异但无临床症状。Sanger测序证实该杂合NFKB2 c.781C>T（p.Arg261Trp; R261W）变异在家族中分离。

**2. Identification of a Detrimental NFKB2 Missense Variant as the Genetic Cause of Hypogammaglobulinemia（鉴定有害NFKB2错义变异为低丙种球蛋白血症的遗传病因）**
通过Western blot和流式细胞术分析患者来源的EBV-B细胞，发现p52水平显著降低（约为健康对照的51%），p100水平中度降低（约73%），提示蛋白质不足，尤其p52丢失严重。BAFF刺激患者幼稚B细胞后，CD86和CD69上调减弱，表明非经典NF-κB2通路功能受损，而BCR介导的经典通路正常。

**3. The R261W Missense Variant Mitigates the Sustainability of the NF-κB2 Transcription Factor Precursor p100 and Causes Subnuclear Mis-localization of the Mature p52 Upon Overexpression（R261W错义变异降低p100可持续性并导致成熟p52亚核定位异常）**
在HEK293T细胞中过表达EGFP-p100-R261W后，荧光强度明显弱于野生型，表明蛋白质稳定性下降。共表达GOF-NIK强制加工后，野生型p52均匀分布于核内，而突变型p52-R261W聚集成致密核内聚集体（中心区域），并挤压DNA至核周。直接过表达EGFP-p52-R261W也呈现类似核内聚集现象，类似于蛋白衰变型NFKB1突变体的特征。

**4. The R261W Missense Variant Prevents Durable p52 Expression（R261W错义变异阻止p52持续表达）**
Western blot定量显示，EGFP-p100-R261W表达水平仅为野生型的55%，而由其细胞内在加工产生的p52-R261W几乎不可检测（仅为野生型水平的6.8%）。共表达GOF-NIK后，野生型p100高效转化为p52（达p100水平的147%），而突变型p100几乎不产生p52。直接过表达EGFP-p52-R261W的蛋白水平也仅为野生型的21%，证实该变异导致p52严重丢失，短p52版本（415和405氨基酸）结果一致。

**5. Cell-intrinsic Processing of p100-R261W Does not Produce Nuclear DNA-binding Activity Although DNA-binding Ability of Ectopically Expressed p52-R261W Remains Preserved（细胞内在加工不产生核DNA结合活性，但异位表达的p52-R261W仍保留DNA结合能力）**
EMSA显示，单独过表达p100-R261W时核提取物中无DNA结合活性。共表达GOF-NIK后，只有野生型p100产生强DNA结合活性，突变型p100-R261W仍无活性。但直接过表达EGFP-p52-R261W后，与野生型p52相似，均检测到DNA结合活性（约为野生型的61%），说明R261W本身不废除DNA结合能力，但降低了蛋白稳定性并阻止其从p100前体有效产生。

**总结讨论**

讨论部分指出，NFKB2 R261W变异导致p52蛋白丢失和p100可持续性降低，属于罕见的“表达缺失”型致病机制，与C端degron突变引起的p100不可加工不同。该变异与轻度低丙种球蛋白血症相关，且呈不完全外显率，可能被低估。相比之下，NFKB1中常见p105/p50单倍体不足，而NFKB2中类似单倍体不足病例少见。研究提示，此类变异应重新评估为致病性，并建议对轻度或仅感染表型的CVID、选择性IgG缺乏或未分类抗体缺陷患者进行NFKB2变异（非C端degron）的功能筛查。研究结论总结如下：**致病性NFKB2变异可分为不同的蛋白缺陷组，各与特定临床症状谱相关。R261W错义变异通过引起p100不稳定及p52严重丢失，导致可遗传的低丙种球蛋白血症。研究人员建议对轻度受影响、反复呼吸道感染患者进行NFKB2表达缺失变异的基因筛查，并在携带者中实施基线评估与年度随访，但疾病自然史仍需进一步研究。**