妊娠期B族链球菌检测中自主研发快速检测方法的验证

《International Journal of Medical Microbiology》：Validation of an in-house developed rapid assay for Group B Streptococcus detection in pregnancy

　　

背景：孕妇体内B族链球菌（Group B Streptococcus，GBS）定植是新生儿感染和早产死产的主要风险因素，凸显了产前检测的必要性。传统培养方法和标准分子检测存在局限性，因此需要一种快速、高效且简便的GBS检测技术。本研究旨在开发和验证一种利用CRISPR/Cas12a系统并结合重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）的自主研发快速检测方法。方法：研究人员建立了一个快速、灵敏且特异的GBS检测平台，采用CRISPR/Cas12a与等温RPA相结合。针对GBS及其他女性生殖道常见病原体进行了特异性评估。通过梯度稀释的GBS来源质粒确定检测限，并利用孕妇临床拭子样本与商业定量实时PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）检测方法比较诊断效能。结果：该GBS快速检测方法效率高，一小时内完成检测，结果可通过肉眼观察或荧光读取仪判读。该方法能准确区分GBS与非靶标对照病原体，通过胶体金试纸条评估，检测限为201.64拷贝/μl（95%置信区间 [95% Confidence Interval, 95% CI]：66.90–607.75）。在对1000份孕妇阴道-直肠拭子进行的临床性能评估中，快速检测结果与传统qPCR方法密切相关。结论：研究人员开发并验证了一种操作简便、周转时间短的GBS检测方法，具有高灵敏度、高特异性和高准确性，显示出显著的临床应用潜力。

**研究背景与问题**
B族链球菌（Group B Streptococcus，GBS）又称无乳链球菌（Streptococcus agalactiae），是导致新生儿感染的主要原因。孕妇泌尿生殖道和胃肠道中的GBS定植是新生儿GBS早发型疾病（GBS-EOD）的首要风险因素。约50%的定植孕妇可通过垂直传播将细菌传给新生儿，若未进行产时抗生素预防，1%–2%的新生儿可能发展为GBS-EOD。因此，有效的预防措施包括通过阴道-直肠培养进行普遍产前筛查、规范标本采集与处理、合理使用产时抗生素预防以及儿科协作。国际指南（如美国妇产科医师学会ACOG）推荐在妊娠35–37周进行GBS筛查；中国专家共识也沿用该筛查孕周。尽管已有多种检测方法，但微生物培养（金标准）需约48小时，且35–37周培养结果可能无法准确反映分娩时携带状态；聚合酶链反应（PCR）虽更准确，但需复杂设备和专业实验室。因此，亟需一种快速、便捷的分子检测方法以弥补现有缺陷。本研究旨在开发一种结合重组酶聚合酶扩增（RPA）与CRISPR/Cas12a系统的快速检测平台，并验证其在孕妇GBS检测中的性能。论文发表在《International Journal of Medical Microbiology》。

**关键技术与方法**
本研究主要采用三大技术：重组酶聚合酶扩增（RPA）等温扩增技术，在37–42°C下于15分钟内高效扩增靶标DNA；CRISPR/Cas12a系统，通过设计靶向GBS *cfb*基因的crRNA引导LbCas12a蛋白特异性识别并切割靶DNA，同时激活非特异性ssDNA反式切割活性；检测信号输出包括荧光报告系统（利用FAM-BHQ1荧光淬灭探针）和胶体金试纸条（基于FAM-生物素标记探针的免疫层析）。样本队列来源于北京妇产医院、中国人民解放军总医院第七医学中心及北京朝阳医院，共1000份阴道-直肠拭子（500份qPCR阳性、500份qPCR阴性）。关键步骤包括：Chelex 100核酸释放、RPA反应（37°C, 15 min）、CRISPR/Cas12a切割（37°C, 15 min），最终通过荧光读取或胶体金试纸条判读结果。

**研究结果**
**3.1 快速检测方法的优化**
研究人员通过整合RPA与CRISPR/Cas12a步骤，成功构建了GBS快速检测系统。核酸释放采用5% Chelex 100于室温处理10分钟；RPA于37°C扩增15分钟；CRISPR/Cas12a反应于37°C孵育15分钟；最终产物通过胶体金试纸条判读，阳性结果显示检测线和控制线两条红线，阴性仅显示控制线。

**3.2 Cas12a蛋白的表达、纯化与活性验证**
将pET-28a(+)-TEV-LbCas12a质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导表达，超声裂解后通过Ni-NTA亲和层析纯化LbCas12a蛋白。BCA法测定浓度，SDS-PAGE验证纯度。利用HPV18 L1质粒和荧光ssDNA报告系统验证酶活性：仅当靶DNA和crRNA同时存在时，荧光信号随时间显著增加，证实LbCas12a具有特异性反式切割活性。

**3.3 分析灵敏度**
基于GBS *cfb*基因设计RPA引物和crRNA（crRNA1和crRNA2）。以合成的GBS *cfb*质粒为标准品，荧光检测法显示crRNA1条件下灵敏度达1拷贝/μl，而qPCR法灵敏度为10拷贝。优化反应时间（RPA 15 min, Cas12a 15 min）后，胶体金试纸条在100拷贝/μl下稳定检出阳性。Probit回归分析（25次重复）确定检测限（LoD）为201.64拷贝/μl（95% CI：66.90–607.75），该统计值更稳健地反映了分析灵敏度。

**3.4 分析特异性**
在优化条件下，分别用荧光检测和胶体金试纸条测试GBS及常见女性生殖道病原体（大肠杆菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、光滑念珠菌、人乳头瘤病毒、沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、人型支原体、解脲脲原体）。结果显示仅GBS呈阳性，表明该检测系统具有高度特异性，与qPCR方法一致。

**3.5 CRISPR/Cas12a方法检测临床样本中的GBS**
对1000份孕妇阴道-直肠拭子（500份qPCR阳性、500份qPCR阴性）进行检测，CRISPR/Cas12a荧光法与qPCR结果一致：490份阳性、492份阴性。统计分析显示灵敏度98.0%（95% CI：96.8–99.2）、特异性98.4%（95% CI：97.3–99.5）、阳性预测值98.39%（95% CI：97.3–99.5）、阴性预测值98.0%（95% CI：96.8–99.2），Cohen's kappa系数0.964（95% CI：0.840–1.000），总符合率98.2%。18份不一致样本的后续qPCR复查提示可能为低拷贝或样本降解。

**讨论与结论**
讨论部分指出，RPA在37–42°C高效工作，无需复杂温控设备，与CRISPR/Cas12a温度兼容，可整合为“一管式”反应系统。RPA较环介导等温扩增（LAMP）更便捷（仅需一对引物），且能耐受PCR抑制物。CRISPR/Cas12a通过crRNA引导的特异性顺式切割和激活后的非特异性反式切割实现信号放大，灵敏度可达10^-18 mol/L。本研究两种crRNA均有效引导LbCas12a，胶体金试纸条和荧光检测灵敏度分别达100拷贝/μl和1拷贝/μl。与Cepheid Xpert GBS检测相比，本方法灵敏度98.0%、特异性98.4%，性能相当。但研究存在局限性：未以富集培养为标准进行对比；气溶胶污染风险；当前两步法不适合床旁检测；试剂可能降解。未来将开发冻干、闭管的一管式系统。结论翻译：总之，研究人员开发并验证了一种操作简便、周转时间短的GBS检测方法，具有高灵敏度、高特异性和高准确性，表明其在临床实验室中具有显著的潜在应用价值。