骨化三醇抑制血小板活化和血栓形成，减轻代谢功能障碍相关脂肪性肝病的心血管风险

《JACC: Basic to Translational Science》：Calcitriol Suppresses Platelet Activation and Thrombosis, Mitigating Cardiovascular Risks in Metabolic Dysfunction–Associated Steatotic Liver Disease

　　

代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）与维生素D缺乏相关，且血小板呈现过度活化。研究人员提供了关于代谢功能障碍相关脂肪性肝病患者血小板过度反应性和血栓风险机制的新见解，证明骨化三醇（calcitriol）激活巨核细胞和血小板中的维生素D受体（VDR），导致P2Y₁₂表达下调，并调节环磷酸腺苷/蛋白激酶A（cAMP/PKA）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，从而减弱血小板活化。

**论文解读：骨化三醇通过维生素D受体调控血小板功能及代谢功能障碍相关脂肪性肝病血栓风险**

**研究背景与问题**
维生素D（vitamin D）是一种脂溶性类固醇激素，其活性形式1,25-二羟基维生素D₃（1,25(OH)₂D₃，即骨化三醇）传统上被认为参与骨与矿物质代谢。然而，大量观察性数据显示，低血浆25-羟基维生素D（25(OH)D）水平与缺血性心脏病、心肌梗死（MI）、缺血性卒中（IS）和外周动脉疾病风险升高相关，这些疾病均涉及动脉血栓形成和血小板活化。血小板活化是血栓形成的核心环节，但维生素D对血小板的直接作用及机制尚未完全明确。代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）是常见慢性肝病，也是心血管疾病（CVD）的重要危险因素，且MASLD患者常伴维生素D缺乏和血小板过度活化。然而，维生素D缺乏与血小板高反应性之间的相互关联及其对血栓形成的潜在贡献仍需深入探究。研究人员开展本研究，旨在阐明骨化三醇对血小板活化和血栓形成的调控机制，并评估其在MASLD相关血栓风险中的治疗潜力。论文发表在《JACC: Basic to Translational Science》。

**主要技术方法**
研究人员采用多水平研究方法。人类研究包括：从复旦大学附属中山医院招募118名健康参与者（排除CVD、MASLD、糖尿病等）进行血浆骨化三醇与血小板聚集相关性分析；对10名健康志愿者和10名MASLD患者进行为期2周的骨化三醇干预试验（0.25 μg，每日两次），检测干预前后血小板活化指标。动物研究使用野生型（WT）C57BL/6J小鼠和维生素D受体敲除（Vdr^-/-）小鼠，通过Western diet（WD）或蛋氨酸-胆碱缺乏饮食（MCDD）诱导MASLD模型，并给予骨化三醇灌胃（50 ng/kg/天）2周。体外实验采用人及小鼠洗涤血小板（WP），以不同浓度骨化三醇处理，检测血小板聚集、ATP释放、P-选择素表达、整合素α_IIbβ₃活化、铺展及血块回缩。机制研究运用RNA测序、染色质免疫共沉淀（ChIP）、荧光素酶报告基因、共免疫沉淀及Western blotting分析VDR与P2Y₁₂启动子结合及下游信号通路（cAMP/PKA、MAPK）。体内血栓模型包括FeCl₃诱导肠系膜动脉血栓、胶原/肾上腺素诱导肺栓塞、心肌缺血再灌注（I/R）及大脑中动脉闭塞模型。

**研究结果**
**Ingestion of calcitriol inhibits the activity of human platelets**（骨化三醇摄入抑制人血小板活性）：在118名健康参与者中，血浆骨化三醇水平与二磷酸腺苷（ADP）和胶原诱导的血小板聚集呈负相关（Spearman r = ?0.33和?0.29，P < 0.01）。10名健康志愿者口服骨化三醇2周后，血浆骨化三醇水平升高，血小板聚集、P-选择素表达及整合素α_IIbβ₃活化显著降低。
**Calcitriol administration inhibits the activity of mouse platelets**（骨化三醇给药抑制小鼠血小板活性）：WT小鼠灌胃骨化三醇2周后，PRP及洗涤血小板中ADP、胶原或凝血酶诱导的血小板聚集、ATP释放、P-选择素表达和α_IIbβ₃活化均被抑制，血小板铺展和血块回缩减弱。体内FeCl₃诱导肠系膜动脉血栓形成减少，而尾出血时间无显著变化。
**Calcitriol directly inhibits human platelet activation in vitro**（骨化三醇直接抑制人血小板活化）：非活性形式25(OH)D₃（50 ng/mL）对人血小板聚集无影响。骨化三醇以浓度依赖性方式（20-100 pg/mL）抑制ADP、胶原和凝血酶诱导的血小板聚集、ATP释放、P-选择素释放及整合素α_IIbβ₃活化，并抑制血小板铺展和血块回缩，最佳浓度为60 pg/mL。
**Calcitriol binds to VDR in platelets to modulate platelet activation and in vivo thrombosis**（骨化三醇与血小板VDR结合调节血小板活化和体内血栓形成）：Vdr^-/-小鼠血小板计数和颗粒数量正常，但骨化三醇的抑制作用在VDR拮抗剂MeTC7预处理或Vdr^-/-血小板中消失。体内实验中，接受骨化三醇处理WT血小板的受体小鼠血栓形成减少，而接受Vdr^-/-血小板的则无此效应。
**Calcitriol downregulates platelet P2Y12 receptor expression**（骨化三醇下调血小板P2Y₁₂受体表达）：RNA测序表明，骨化三醇处理后WT小鼠血小板中P2Y₁₂受体基因表达显著下调，而P2Y1、PAR4、GPVI等受体mRNA水平不变。Western blotting和流式细胞术证实P2Y₁₂蛋白水平降低。
**Calcitriol-activated VDR downregulates P2Y12 transcription in megakaryocytes**（骨化三醇活化的VDR在巨核细胞中下调P2Y₁₂转录）：在Meg-01细胞中，骨化三醇诱导VDR与类视黄醇X受体（RXR）形成异二聚体，ChIP及ChIP-seq显示VDR富集于P2Y₁₂启动子区域。荧光素酶报告基因鉴定出关键结合基序1628TAGGTTCA1635，突变后VDR介导的抑制消失。
**Calcitriol regulates downstream signaling pathways of platelet VDR to decrease platelet activation**（骨化三醇调节血小板VDR下游信号通路降低血小板活化）：骨化三醇浓度依赖性升高人血小板cAMP水平及PKA磷酸化，抑制PKC、ERK1/2、JNK和p38磷酸化。这些效应在MeTC7存在或Vdr^-/-血小板中消失。
**Calcitriol addresses platelet hyperactivity of patients with MASLD**（骨化三醇改善MASLD患者血小板过度活性）：89名MASLD患者血浆骨化三醇水平低于健康对照，且与ADP和胶原诱导的血小板聚集呈负相关（Spearman r = ?0.46和?0.37，P < 0.01）。10名MASLD患者骨化三醇干预后，血小板聚集、P-选择素和整合素α_IIbβ₃活化降低。MASLD血浆可增强健康血小板聚集和血块回缩，骨化三醇处理可逆转此效应。微流体全血灌注实验中，骨化三醇减少MASLD血液在胶原上的血栓形成。
**Calcitriol administration inhibits platelet activation and thrombosis in MASLD mice**（骨化三醇给药抑制MASLD小鼠血小板活化和血栓形成）：WD诱导的MASLD小鼠血浆维生素D水平降低，肝内血小板浸润增加。骨化三醇灌胃降低MASLD小鼠PRP血小板聚集，抑制肠系膜动脉血栓形成，并增强氯吡格雷的抗血小板作用，不延长出血时间。MCDD诱导的MASLD小鼠类似。P2Y₁₂受体在MASLD小鼠血小板中过表达，骨化三醇可逆转，并恢复VDR在P2Y₁₂启动子的富集。
**Calcitriol attenuates thromboembolism and microvascular thrombosis in MASLD mice**（骨化三醇减轻MASLD小鼠血栓栓塞和微血管血栓）：胶原/肾上腺素诱导肺栓塞模型中，骨化三醇减少MASLD小鼠肺血管血栓数量。心肌I/R损伤模型中，骨化三醇降低MASLD小鼠梗死面积/危险区比，减少心肌微血管血栓，改善左室射血分数（LVEF）和左室容积参数。大脑中动脉闭塞模型中，骨化三醇减少脑梗死体积和微血管血栓。微血管血栓与梗死面积正相关，与LVEF负相关。

**总结讨论与结论**
讨论指出，维生素D缺乏与CVD风险升高相关，骨化三醇通过VDR依赖机制抑制血小板活化。基因组效应：VDR-RXR异二聚体直接结合P2Y₁₂启动子VDRE，下调巨核细胞P2Y₁₂转录，减少循环血小板P2Y₁₂水平。非基因组效应：骨化三醇激活cAMP/PKA通路，抑制MAPK通路，即时减弱血小板反应性。在MASLD中，骨化三醇干预可降低血小板过度活性，保护重要器官免受梗死。研究局限性包括：VDR是否通过核因子-κB间接调控P2Y₁₂尚不明确；凝血因子、内皮功能等因素可能参与；排除已有CVD的MASLD患者可能限制普适性。
**研究结论**：本研究揭示了一种先前未被认识的骨化三醇调控血小板功能和血栓风险的机制。骨化三醇通过靶向巨核细胞和血小板中的VDR，涉及P2Y₁₂下调和cAMP/PKA激活伴随MAPK抑制，从而减少血小板活化和血栓形成。结果表明，骨化三醇补充可能为MASLD相关血栓形成提供有价值的治疗策略，从而保护关键器官免受梗死。