《Journal of Advanced Research》：Perceptual interactions and predicted mechanism in binary odorant mixtures of baked green tea (Camellia sinensis cv. Zhongcha 302)
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茶因其风味而在全球备受重视，香气是关键品质指标。为充分理解源于复杂感知交互的茶香气，需要整合感知复杂性与基质效应的系统分子感官组学（sensomics），这一关键整合仍是该领域尚未解决的核心挑战。源自‘中茶302’（Camellia sinensis cv.
茶因其风味而在全球备受重视，香气是关键品质指标。为充分理解源于复杂感知交互的茶香气，需要整合感知复杂性与基质效应的系统分子感官组学（sensomics），这一关键整合仍是该领域尚未解决的核心挑战。源自‘中茶302’（Camellia sinensis cv. Zhongcha 302，ZC302）的烘青绿茶以其优越风味著称，但其关键气味物及其形成机制仍不清楚。本研究旨在鉴定这些关键气味物，并阐明二元混合物中的感知交互作用及预测机制。研究人员通过集成感官组学方法鉴定关键气味物；使用3?AFC测试、S?曲线和气味活性值（odor activity value，OAV）计算评估二元气味物对的感知交互，并在茶空白基质中进一步验证；进行分子对接（molecular docking）和分子动力学模拟（molecular dynamics simulation）以表征气味物与嗅觉受体（olfactory receptor，OR）的结合并预测结合模式。七种关键气味物产生21个二元对，归类为13个协同、六个掩蔽、一个加和以及一个无交互。加和对（香叶醇 geraniol & 水杨酸甲酯 methyl salicylate）和掩蔽对（香叶醇 geraniol & 反式?β?紫罗兰酮 trans?β?ionone）在水相和茶基质中均一致调控“花香”属性。分子对接和分子动力学模拟表明，加和气味对通过增强氢键、疏水相互作用和有利的静电互补性，与OR1G1形成高度兼容且稳定的复合物。在该二元气味物系统中，水杨酸甲酯稳定锚定在受体胞外域，而香叶醇动态调节受体结构柔性。ZC302烘青绿茶中的关键气味物主要通过加和或掩蔽效应交互，其感知结果由与嗅觉受体的不同结合模式所调控。茶基质关键性地调节气味交互模式并显著影响香气感知的真实性。
研究背景方面，茶香气是品质的关键指标，目前已鉴定出超过700种挥发性化合物，但香气形成并非单一挥发性化合物的加和效应，而是气味分子间的感知交互（包括协同、加和、掩蔽效应）在塑造茶香气整体构成中起关键作用。当前研究方法存在局限，多依赖气味活性值筛选等便捷实验方法，难以充分捕捉人类嗅觉感知的多维性；即使在开展综合感官组学分析的研究中，也常忽视复杂茶基质与简化水模型系统在组成和理化性质上的显著差异，可能妨碍关键气味物的准确识别并阻碍对其协同或抑制交互机制的理解决策。烘青绿茶技术最简单，较好保留品种原有风味，但关于烘青绿茶中关键气味物交互及其潜在机制的理解仍显著缺乏，且这些化合物在不同茶类中浓度、比例和贡献差异较大，因此需在真实样品系统中进行组成分析以理解其感知交互。中茶302（ZC302）是国家认定的茶树克隆品种，其烘青绿茶以锐香、鲜爽、汤色绿亮著称，此前虽鉴定出57种气味物并归类至六大香族，但负责其优异香气品质的关键气味物仍未探明。为此，研究人员旨在阐明ZC302烘青绿茶关键气味物，调查其二元气味物混合物中的感知交互并预测结构结合模式。
该研究发表在《Journal of Advanced Research》。研究人员首先基于既往风味稀释（flavor dilution，FD）因子、气相色谱?嗅觉/质谱（gas chromatography–olfactometry/mass spectrometry，GC?O/MS）分析获得的香气强度（aroma intensity，AI）值，结合真实标准品的直接强度评估和香气省略/添加实验，从各香族中鉴定关键气味物；随后使用S?曲线法和OAV计算系统分析烘青绿茶中关键气味物间二元交互，将各二元混合物纳入空白茶基质并通过定量描述分析（quantitative descriptive analysis，QDA）验证交互效应；最后采用分子对接和分子动力学模拟探索具显著交互效应的气味物组合与五种广谱嗅觉受体（OR1A1、OR1D2、OR1G1、OR2W1、OR52D1）的结合模式。样本为ZC302烘青绿茶，由中茶302品种按摊放、杀青、揉捻、烘焙工艺制成，空白茶基质通过反复加热、真空浓缩和烘箱干燥去除挥发性成分制备。
关键技术方法方面，研究人员主要采用集成感官组学方法鉴定关键气味物；采用3?AFC测试结合S?曲线法测定单一及二元气味物嗅觉阈值，基于Feller加性模型通过OT(exp)/OT(the)比值（D值）和OAV(the)/OAV(exp)比值（X值）判定交互类型；在去挥发性空白茶基质中进行二元混合物添加并结合QDA评估香气属性变化以验证基质中交互；采用AlphaFold预测嗅觉受体结构，使用AutoDock Vina进行单一及二元配体分子对接，分析结合能、氢键、空间构象及静电势（electrostatic potential，ESP）互补；采用GROMACS进行100 ns分子动力学模拟，通过溶剂可及表面积（solvent?accessible surface area，SASA）、均方根波动（root?mean?square fluctuation，RMSF）、均方根偏差（root?mean?square deviation，RMSD）、回转半径（radius of gyration，Rg）及分子力学/泊松?玻尔兹曼表面积（Molecular Mechanics/Poisson–Boltzmann Surface Area，MM/PBSA）计算分析复合物动态稳定性与结合自由能。
研究结果部分，首先在直接香气强度评估中，研究人员在统一浓度下对50种已鉴定气味物的真实标准品进行直接香气强度评估，发现“花香”组气味物直接香气强度显著高于其他组，香叶醇和trans?β?ionone具最高FD因子及显著AI和直接香气强度，水杨酸甲酯在“青香”组最高，多数气味物FD、AI和直接香气强度呈强相关，据此筛选出11种潜在关键气味物并进行省略/添加实验验证。
在关键气味物确定中，研究人员优先以FD值≥128为核心筛选指标并结合AI和直接香气强度综合评估，最终确定7种关键气味物：香叶醇和trans?β?ionone（花香组）、β?柠檬醛（β?Citral）、壬醛（nonanal）、(E)?2?壬烯醛（(E)?2?nonanal）和水杨酸甲酯（青香组）、trans?芳樟醇氧化物（吡喃型）（trans?linalool oxide (pyranoid)）和(Z)?3?己烯基丁酸酯（草本组）、茉莉内酯（jasmine lactone，甜香组）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，烘香组）及庚醛（heptanal，其他组）；省略实验显示香叶醇缺失显著降低“花香”属性，添加则增强；trans?β?ionone添加增强“花香”和“甜香”但在省略中反而增加这两属性，提示其具潜在抑制效应；水杨酸甲酯添加增强“花香”、省略则增加“花香”，提示其为浓度依赖性双重调节物；最终选定具单次或双重显著贡献的7种挥发物为ZC302烘青绿茶关键气味物。
在单一及二元混合物气味阈值测定中，研究人员通过3?AFC结合S?曲线法自测7种关键气味物阈值，trans?β?ionone最低（0.0029 μg/kg），茉莉内酯最高（2044.09 μg/kg），差异超70万倍；基于ZC302中实际浓度按比例制备21组二元混合物，测定实验阈值OT(exp)和理论阈值OT(the)，范围分别为0.00035–1111.99 μg/kg和0.0044–2063.95 μg/kg，显示气味物间存在显著交互调节整体嗅觉感知。
在二元气味物混合物感知交互调查中，研究人员基于OT(exp)与OT(the)比较，通过计算D值判定水介质中交互类型：13组协同（D＝0.08–0.45）、1组加和（D＝0.88，香叶醇&水杨酸甲酯）、6组掩蔽（D＝1.12–6.69）、1组无交互（D＝1.00）；同步计算X值（OAV(the)/OAV(exp)）与D值一致，证实分类可靠；水介质中大部分二元混合物OAV大于1，证实香气化合物间存在显著交互。
在空白茶基质中二元气味物混合物感知交互验证中，研究人员将21组二元混合物按实际浓度加入去挥发性空白茶基质进行QDA，发现水介质中13组协同在茶基质中均减弱为加和效应，仅香叶醇&trans?β?ionone（掩蔽）和香叶醇&水杨酸甲酯（加和）在两基质中完全一致；β?柠檬醛&茉莉内酯在水介质为协同而在茶基质呈掩蔽；6组水介质掩蔽中仅香叶醇&trans?β?ionone保持掩蔽，其余转为加和甚至协同；6组水介质协同在茶基质中被显著抑制为无交互，主要与β?柠檬醛相关，归因于非挥发性茶组分结合、基质黏度及浓度接近阈值等理化机制调节；表明茶基质显著调节气味交互模式并影响香气感知真实性。
在单一气味物与五种人嗅觉受体分子对接研究中，研究人员计算三种单一气味物（香叶醇、水杨酸甲酯、trans?β?ionone）与五种广谱嗅觉受体（OR1A1、OR1D2、OR1G1、OR2W1、OR52D1）结合亲和力，trans?β?ionone对所有受体结合最强（ΔG＝?7.62至?6.27 kcal/mol），香叶醇和水杨酸甲酯结合能分别为?6.56和?6.67 kcal/mol（对OR1A1）；所有三种气味物均与受体形成氢键及疏水相互作用（烷基、Pi?烷基、Pi?Pi堆积），如OR1A1的ASN109和GLY202与香叶醇羟基形成氢键，ASN155与水杨酸甲酯和trans?β?ionone羰基形成氢键，支持强结合能力。
在二元气味物混合物与五种人嗅觉受体分子对接研究中，研究人员评估两典型二元对（香叶醇&水杨酸甲酯?加和；香叶醇&trans?β?ionone?掩蔽）与五种受体结合，二元体系结合能均低于?7 kcal/mol约?10 kcal/mol；加和对结合能（?10.13至?9.04 kcal/mol）略高于掩蔽对（?10.80至?9.80 kcal/mol），但加和对在OR1A1、OR1G1、OR2W1上形成更多氢键（如加和对中水杨酸甲酯与OR1G1的PHE17、GLN24、LEU14、GLN90形成多达5个氢键），且结合于已报道功能活性位点，掩蔽对中trans?β?ionone未能形成有效氢键且结合位点非典型活性位；空间构象上OR1G1与加和对形成兼容结合口袋（水杨酸甲酯位于胞外域，香叶醇位于跨膜域底部），与掩蔽对结合较差；静电势分析显示加和对与OR1G1表面静电互补良好（正电位氢与负电位受体区匹配），掩蔽对则无有利互补；加和对还与OR1G1形成稳定疏水相互作用网络（TYR278、SER255、VAL108、PHE251等），共同稳定活性口袋。
在OR1G1?配体复合物分子动力学模拟结果中，研究人员对OR1G1?香叶醇（单配体对照）、OR1G1?香叶醇&trans?β?ionone（掩蔽）、OR1G1?香叶醇&水杨酸甲酯（加和）进行100 ns分子动力学模拟；溶剂可及表面积显示加和系统波动最大，源于香叶醇30–40 ns解离后50 ns反弹至胞外伴随构象重排；均方根波动显示掩蔽组胞外环（extracellular loop，ECL）波动最高但为非协同扰动，加和组维持适度功能性ECL柔性；均方根偏差显示加和组平台最高（0.35–0.40 nm），表明二元配体共结合诱导广泛构象重塑；回转半径显示加和在50–100 ns稳定期稍高，表明受体适度扩张松散；氢键分析显示加和中水杨酸甲酯比掩蔽中trans?β?ionone形成更稳定氢键，香叶醇在加和中实现更高频率氢键；结构快照显示掩蔽组中trans?β?ionone持续占据中心空腔产生空间位阻限制香叶醇参与核心调控，锁住受体非活性构象；加和组采取非竞争分区结合模式，水杨酸甲酯稳定锚定胞外域，香叶醇早期解离约41 ns重新稳定结合胞外域，消除竞争冲突并诱导跨膜螺旋6（transmembrane helix 6，TM6）向外倾斜的典型GPCR激活构象；MM/PBSA显示加和组气相能量更低（ΔGGAS＝?47.98 kcal/mol vs 掩蔽?40.52）、静电能更强（ΔEEEL＝?8.34 vs 掩蔽?0.51），但总结合自由能略低（ΔTOTAL＝?27.91 vs 掩蔽?30.38）源于更高极性溶剂化能（ΔEPB＝24.33 vs 掩蔽15.10）的去溶剂化惩罚；残基分解显示掩蔽组中trans?β?ionone通过ILE199、VAL108、PHE104、MET105稳定疏水占据核心空腔僵化构象，香叶醇仅弱外围接触；加和中水杨酸甲酯与GLN90、PHE17、GLN24、LEU14形成持续氢键网络（GLN90贡献?0.96 kcal/mol）并辅以疏水作用，协同香叶醇诱导结构柔性稳定TM6外倾活性构象，促进嗅觉信号转导产生气味加和增强效应。
讨论与结论部分，研究人员总结在ZC302烘青绿茶二元气味物混合物中，基于AI、FD及浓度鉴定7种关键气味物并经直接强度评估与省略/添加实验验证；通过3?AFC、S?曲线和OAV计算评估21个二元对交互并在茶空白基质验证，仅香叶醇&trans?β?ionone（掩蔽）和香叶醇&水杨酸甲酯（加和）在两介质中高度一致，其余多数协同在基质中减弱、少数相反；分子对接表明加和对与OR1G1在跨膜和ECL区功能活性位点形成稳定氢键与疏水网络及匹配静电特征，分子动力学模拟证实加和组非竞争分区结合（水杨酸甲酯锚定胞外域、香叶醇动态调节柔性）触发功能构象重排（结构扩张、TM6外倾），虽去溶剂化能增加和结合自由能略降但维持适度ECL门控柔性与稳定残基相互作用，促进OR1G1激活与信号转导产生加和增强效应。该研究系统调查茶中两气味分子感知交互，建立综合分析框架将香气前沿推进至蛋白质?气味受体交互水平，但限于五种广谱受体，未来可结合人工智能筛选最优配体?受体对、需细胞功能实验验证预测结合模式、扩大评价员群体提升准确性。结论为ZC302烘青绿茶关键气味物主要通过加和或掩蔽效应交互，感知结果由与嗅觉受体不同结合模式调控；茶基质关键性调节气味交互模式并显著影响香气感知真实性；加和系统中二元配体结合模式触发功能性构象重排，可能有效促进OR1G1激活与嗅觉信号转导，最终产生显著气味加和增强效应。
