综述：强效抗癌剂disorazole家族：结构、生物活性、全合成及异源生物合成

《Journal of Advanced Research》：The disorazole family of potent anticancer agents: structures, bioactivity, total synthesis, and heterologous biosynthesis

　　

背景：Disorazoles是一类最初从粘细菌Sorangium cellulosum中分离得到的、具有极强活性的macrodiolide天然产物。它们通过破坏微管动力学发挥皮摩尔级别的细胞毒性，使其成为已知最有效的微管靶向剂（MTAs）之一。其复杂的化学结构，以独特的30元环（A/C系列）和26元环（Z-F家族）大环为特征，为化学合成带来了巨大挑战，同时也为探索构效关系（SAR）和开发新型抗癌疗法提供了丰富的机会。综述目的：本综述旨在对disorazole家族进行全面系统的分析，弥合复杂化学合成与现代生物合成工程之间的差距。研究人员对比了经典和新兴的结构亚家族，批判性地评价了里程碑式的全合成，并强调了合成生物学在克服历史生产瓶颈、实现结构多样化和规模化制造方面的变革性作用。综述的关键科学概念：本综述阐述了disorazole研究中的范式转变：从应对全化学合成的极端挑战（例如，通过大环内酯化或环二聚化合成A1、C1、Z1）转向利用可编程的生物合成工程（F和Z）。研究人员重点介绍了关键技术——特别是异源表达、基于Red/ET重组工程的途径重构，以及模块化聚酮合酶（PKS）工程——如何彻底改变了这些分子的生产和多样化，使得具有改进特性的类似物（如disorazole F）得以产生。最终，本综述以前瞻性视角阐述了这些进展，概述了一种融合生物合成可扩展性与合成化学精准性的未来协同策略，以推动临床转化。

1. Introduction
Disorazoles是一类来自粘细菌Sorangium cellulosum的macrodiolide天然产物，作为新型微管靶向剂（MTAs），具有独特的宏环结构和纳摩尔级细胞毒性。其主要成分disorazole A1表现出极低的半数抑制浓度（IC₅₀），范围为2至42 pmol/L。Disorazoles通过结合微管蛋白，破坏微管动力学，诱导癌细胞凋亡，其机制与紫杉醇或埃博霉素类似但效力更强。此外，disorazoles可通过靶向宿主因子ezrin阻断A族链球菌侵入人上皮细胞。对disorazole C1的构效关系（SAR）研究及全合成探索为理解其化学和生物学活性提供了重要见解。尽管全合成策略已有综述，但其生物合成途径的工程改造（如模块替换和宿主优化）尚未系统总结，这限制了高产菌株的理性设计。研究人员已通过Red/ET重组工程成功实现disorazole A和Z的生物合成基因簇（BGC）的异源表达，并探索了disorazole F₂的生物合成途径及突变优化，为深入工程化聚酮化合物提供了新选择。

2. Structure and bioactivity
2.1. Structure
Disorazoles以宏环二内酯结构为特征，其macrodiolide核心基于两个2-取代的噁唑-4-羧酸单元，通过双内酯核心形成二聚体，并连接有延伸的多不饱和链。这些亚单元可以相同或不同，从而产生多样化的结构类似物。Disorazoles根据结构特征分为A-Z亚类，包括大环内酯环大小（30元环或26元环）和侧链架构的变化。主要成分disorazole A1约占所有disorazoles总量的70%。Disorazole Z作为非典型成员，具有26元环和独特的甲基酯修饰（–COOCH₃），增加了极性，可能增强与微管蛋白的结合亲和力。研究人员通过大规模发酵S. cellulosum So ce1875，于2023年阐明了10种新型disorazole Z类似物（Z₂–Z₁₀）的完整结构。
2.2. Bioactivity
Disorazoles通过破坏微管形成发挥显著的细胞毒性，且能逃避P-糖蛋白介导的耐药性。Disorazole通过抑制微管蛋白聚合，诱导细胞周期阻滞在G₂/M期并最终导致凋亡，其结合位点为β-微管蛋白上的美登素位点。在多种癌细胞系（如A549、PC-3、SK-OV-3）中，disorazole A1在乳腺癌和结肠癌细胞中IC₅₀值小于1 nM，优于埃博霉素。Disorazole C1能诱导有丝分裂停滞，某些非癌细胞系可通过细胞周期蛋白B相关的有丝分裂滑脱逃脱，表明细胞类型依赖性选择性。
2.3. Mechanism
Disorazoles作为微管去稳定剂，结合β-微管蛋白并抑制其聚合，从而干扰有丝分裂纺锤体。高分辨率晶体学（PDB 6FJM）显示disorazole Z结合于β-微管蛋白的美登素位点。早期SAR研究提示disorazole A1的环氧基团可能与微管蛋白形成共价键，但无环氧基团的disorazole C1仍保留纳摩尔级抗增殖活性，证明disorazole骨架本身具有固有的微管破坏活性，其中三维构象和官能团排列至关重要。Disorazole A1在低浓度下诱导caspase-3活性增强和DNA片段化，高浓度下主要导致G₂/M期阻滞。Disorazole C1在非癌细胞中诱导有丝分裂滑脱并导致早衰，具有潜在治疗意义。SAR研究显示，烯丙基醇侧链和三烯骨架对活性至关重要，环氧基团虽增强效力但非必需，C-6甲氧基对结构完整性重要。Disorazoles对P-糖蛋白过表达细胞保持效力。总体而言，disorazole对正常细胞和癌细胞的作用具有化合物和细胞状态依赖性，未来药物开发应优先选择具有增强选择性的类似物。

3. Total synthesis: early attempts to breakthrough
3.1. Macrolactonization strategies (Wipf, Nicolaou, Lizzadro)
Wipf和Graham于2004年首次完成disorazole C1的全合成，采用Sonogashira交叉偶联和Yamaguchi大环内酯化策略，总产率1.5%（20步）。Nicolaou团队通过非对称路线合成了disorazole A1（总产率0.56%，15步），并利用对称性高效合成了disorazole B1，其中将环氧基团替换为环丙烷的bioisostere策略增强了化学稳定性，同时保持皮摩尔级细胞毒性（IC₅₀ ~0.1 nM）。Lizzadro等人在2021年改进了保护基策略，采用Boland条件（Zn-Ag-Cu合金）还原炔烃，将disorazole C1的总产率提升至2.7%（17步）。
3.2. Metal-catalyzed cyclodimerizations (Speed & Hoveyda)
Speed和Hoveyda等人于2014年首次绕过传统大环内酯化，采用Z-选择性交叉复分解和Suzuki环二聚化直接构建天然三烯骨架，总产率7.3%（12步线性序列），但依赖非商业化的Mo基催化剂。
3.3. Alkyne metathesis-driven macrocyclization (Ralston)
Ralston等人采用炔烃复分解（ACM/RCAM）驱动环二聚化，构建disorazole C1的大环二内酯核心，总产率4.2%（19步）。该策略规避了线性precursors的不稳定性，但存在竞争性二聚化和低产率氢化（11%）的挑战。
3.4. Double Stille convergence for Z1 (Schinzer 2025)
Bauer和Schinzer于2025年首次完成(+)-disorazole Z1的全合成，采用双重立体选择性羟醛反应构建C13季碳中心，并通过双Stille偶联实现C2对称性大环化，直接形成26元环，关键步骤产率39%（Stille大环化）和43%（脱保护），为ADC开发提供了C13甲酯作为连接位点。

4. Biosynthetic heterologous expression
4.1. Gene cluster identification: through transposon mutagenesis and genomic mining
Disorazole A型BGC（73 kb）于2005年通过转座子诱变在S. cellulosum So ce12中鉴定，编码三个多肽DszA、DszB、DszC，属于trans-AT I型PKS酶。研究人员通过X射线晶体学解析了trans-AT的结构和机制。Tu等人采用Red/ET重组工程策略，将改造后的BGC（p15A-dis-est）电转入异源宿主Myxococcus xanthus DK1622，首次成功实现粘细菌trans-AT PKS的异源表达，但产量低（disorazole A₂ <1 mg/L）。
4.2. Gene cluster cloning and modification: Red/ET recombination technology for cloning to heterologous host
Red/ET重组技术基于λ噬菌体Redα/Redβ或Rac原噬菌体RecE/RecT系统，无需限制性酶切位点即可实现精确基因编辑。该技术已广泛应用于BGC直接克隆、异源表达和合成生物学，在disorazole研究中通过Red/ET介导的途径重构实现了BGC从S. cellulosum到M. xanthus的转移。
4.3. Heterologous expression strategies: the combinational biosynthesis and systematic optimization, evolution of disorazole Z to F
4.3.1. Heterologous expression optimization: deletion of the external pump (ΔBAC/3P), promoter replacement, host optimization
Gao等人（2023）和Wang等人（2023）通过Red/ET重组工程，在M. xanthus DK1622中异源表达了disorazole Z的BGC，并阐明了其独特生物合成途径。通过删除外排泵基因（ΔBAC/3P）和替换启动子，在工程化宿主Burkholderia thailandensis E264中实现了disorazole F₂的高效生产（38.3 mg/L，相比野生菌株提高7倍）。该宿主还通过整合attB介导的染色体整合，实现了稳定表达。
4.3.2. Pathway engineering and novel analogs: module substitution or module truncation (such as DH domain deletion) generates F-series derivatives
Wang等人通过删除脱水酶（DH）结构域或融合ACP-酮合酶（KS）接头，产生了羟基化衍生物（如13-OH disorazole Z₁）和截短的大环内酯类似物。共表达氧化还原酶disE增强了后PKS修饰。通过域失活突变（DH His→Phe、KR Tyr→Phe、MT GXGXG→GXRXG），生成了disorazole F₂–F₆系列衍生物，这些衍生物缺乏甲基和羟基，细胞毒性降低（IC₅₀ ~10 nM，而disorazole A₁ <1 nM），但为SAR研究提供了平台。

5. Discussion and outlook
5.1. Discussion
Disorazole研究展示了全合成与生物合成工程之间的协同作用：合成工作揭示了SAR并提供了稳定性改进的类似物，而生物合成方法则提供了可扩展的途径并实现了结构多样化。然而，差的药代动力学和对正常组织的毒性需要结构优化和靶向递送系统。关键障碍包括水溶性差、剂量限制性毒性和规模化生产瓶颈。
5.1.1. Structure- bioactivity relationships
Disorazoles根据大环大小和取代基分类：A-I系列（30元环，含环氧基团和gem-二甲基，IC₅₀ 0.0023–14.6 nM），Z系列（26元环，含甲酯，IC₅₀ 0.06–0.43 nM），F系列（30元环，缺失甲基，IC₅₀ 0.25–6.14 nM）。环氧基团对共价结合微管蛋白关键，但导致不稳定；环丙烷bioisostere（如bis-cyclopropyl-B₁）保留纳摩尔活性并增强稳定性。Disorazole C₁通过非共价结合诱导有丝分裂滑脱，减少脱靶毒性。Disorazole Z₁的甲酯修饰提高极性，改善代谢稳定性。
5.1.2. Key synthetic routes
标志性全合成策略包括：Wipf的Yamaguchi大环内酯化（C₁，1.5%），Nicolaou的模块化设计（A₁ 0.56%，B₁ 4.2%），Speed的Suzuki环二聚化（C₁，7.3%），Ralston的炔烃复分解（C₁，4.2%），以及Schinzer的双Stille偶联（Z₁，关键步骤产率39%）。这些方法从线性大环内酯化演变为更高效的对称性驱动环二聚化，但可扩展性仍是挑战。
5.1.3. The biosynthesis and heterologous expression of the structural evolution
Disorazole生物合成基因簇（BGC）属于trans-AT PKS/NRPS系统。通过异源表达（如M. xanthus, B. thailandensis E264）和途径工程（如删除DH域、替换启动子、删除外排泵），实现了disorazole F系列的生产。然而，异源宿主缺乏天然后PKS修饰酶（如甲基转移酶、细胞色素P450），导致产物简化（如F₂缺失甲基和羟基），细胞毒性降低。这强调了共表达修饰酶以恢复结构完整性的必要性。
5.1.4. Comparative analysis and future convergence of synthetic and biosynthetic approaches
全合成提供精确的类似物设计（如环丙烷替换、内酰胺替换），但产率低；生物合成提供可扩展的宏环骨架，但修饰范围受限。未来最佳策略是协同整合：利用工程化生物合成高效生产核心中间体，再通过合成化学进行精确修饰（如生物正交偶联用于ADC，引入稳定bioisostere）。这种混合策略将生物学可扩展性与化学精准性结合，是推动disorazole临床转化的关键。
5.2. Outlook
Disorazoles面临水溶性差、毒性大和体内不稳定性等临床障碍。未来方向包括：基于C13甲酯的ADC开发；利用AI（如AlphaFold 3）预测PKS结构域相互作用和微管蛋白结合，指导理性设计；开发细胞游离合成生物学系统以绕过宿主毒性；以及纳米颗粒和工程化细菌载体等靶向递送策略。通过整合计算设计、生物制造和化学创新，disorazoles有望从先导化合物演变为下一代抗癌疗法。