Piezo1抑制促进MELK降解并阻碍流感病毒进入宿主细胞

《Journal of Advanced Research》：Piezo1 inhibition promoted MELK degradation and impeded influenza virus entry into host cells

　　

摘要
引言
流感病毒仍然是对全球公共卫生持续且重大的挑战。病毒进入宿主细胞是病毒生命周期中关键的初始步骤；然而，参与这一过程的宿主因子调控网络，尤其是Piezo机械敏感元件的作用，尚未完全阐明。
目的
确定Piezo1在流感病毒感染期间呼吸道上皮细胞中的确切作用，并在体内验证靶向Piezo1的抗病毒功效。
方法
本研究通过基因编辑、蛋白质组学和免疫沉淀-质谱联用（IP-MS）筛选，阐明了Piezo1-MELK轴介导流感病毒进入宿主细胞的分子机制，并在基因敲除小鼠模型中验证了靶向Piezo1的抗流感效果。
结果
研究人员发现，Piezo型机械敏感离子通道组分1（Piezo1）对甲型流感病毒（IAV）的进入至关重要。机制上，Piezo1稳定母系胚胎亮氨酸拉链激酶（MELK），研究人员将MELK鉴定为一种新型的IAV内吞受体，该受体可结合病毒血凝素（HA）。此外，流感病毒通过MELK与Piezo1相互作用，导致钙离子内流和F-肌动蛋白（F-actin）聚合，从而驱动流感病毒进入。重要的是，在小鼠肺部特异性抑制或敲除Piezo1可显著提高流感病毒感染期间的存活率。
结论
本研究揭示了协调IAV附着和内吞的Piezo1-MELK轴，表明靶向Piezo1可能是一种有前景的宿主导向抗病毒策略。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**

季节性流感持续对全球公共卫生构成重大威胁，可导致肺炎和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）等严重呼吸系统并发症，甚至死亡。尽管已有预防性疫苗和治疗性抗病毒药物，但在高危人群中这些问题依然突出。流感病毒还具备大流行潜力，例如H1N1、H2N2和H3N2等亚型在过去一个世纪中引发了四次重大大流行，导致超过5000万人死亡。此外，H5和H7亚型禽流感病毒在人间已造成超过2600例确诊病例和1000多例死亡，并给家禽业带来巨大经济损失。

流感病毒感染始于病毒血凝素（HA）与宿主细胞膜上唾液酸受体的结合。然而，并非所有唾液酸化蛋白都能介导有效内吞，只有特定亚群的N-连接糖蛋白才作为真正的进入介质。Piezo1是一种机械门控离子通道，可传导Ca²⁺和Mg²⁺离子，在多种免疫细胞中发挥免疫调节作用。虽然已知Piezo1在流感病毒感染中通过诱导中性粒细胞胞外陷阱（NET）释放促进巨噬细胞分化，但流感病毒主要靶向呼吸道上皮细胞而非巨噬细胞，因此Piezo1在呼吸道上皮细胞中的确切作用仍不清楚。母系胚胎亮氨酸拉链激酶（MELK）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，近期被鉴定为病毒感染的关键宿主因子，但MELK是否直接调控IAV早期进入阶段（尤其是病毒内吞和膜融合）以及Piezo1与MELK之间的潜在关系尚不明确。本研究旨在阐明Piezo1和MELK在流感病毒进入宿主细胞中的分子机制，并验证靶向Piezo1的体内抗病毒效果。

**研究内容与结论**

研究人员发现，在永生化人呼吸道上皮细胞系中敲除或抑制Piezo1可有效抑制流感病毒感染。Piezo1蛋白定位于细胞表面，能与流感病毒HA蛋白相互作用，但这种相互作用是间接的。通过免疫沉淀-质谱联用（IP-MS）筛选，研究人员鉴定出MELK作为介导Piezo1与HA互作的中间蛋白。MELK直接结合流感病毒HA蛋白，作为内吞受体发挥作用；而Piezo1则通过结合MELK并保护其免受泛素-蛋白酶体系统介导的降解，从而稳定MELK表达。此外，流感病毒感染通过MELK与Piezo1的相互作用导致钙离子内流和F-肌动蛋白（F-actin）聚合，进而驱动病毒内吞。在小鼠模型中，鼻腔给予Piezo1抑制剂GsMTx4或在肺部特异性敲除Piezo1基因，均可显著降低致死性甲型流感病毒（IAV）感染小鼠的死亡率。该研究揭示了Piezo1-MELK轴协调IAV附着和内吞的新机制，表明靶向Piezo1是一种有前景的宿主导向抗病毒策略。论文发表在《Journal of Advanced Research》。

**主要关键技术方法**

研究人员主要采用了以下关键技术方法：1）CRISPR-Cas9基因编辑技术构建Piezo1和MELK敲除的A549及BEAS-2B细胞单克隆株；2）非标记定量蛋白质组学（label-free quantitative proteomics）分析Piezo1敲除后差异表达蛋白及信号通路；3）免疫沉淀-质谱联用（IP-MS）筛选与Piezo1和HA同时互作的候选膜蛋白；4）细胞外pull-down实验验证蛋白直接互作；5）在小鼠模型（样本来源：C57BL/6J背景的Piezo1^fl/fl Sftpc-CreERT2条件性敲除小鼠和BALB/c小鼠）中通过鼻腔给药GsMTx4或遗传敲除进行体内抗病毒评价。此外还用到流式细胞术检测唾液酸化修饰、共聚焦显微镜观察F-actin聚合与病毒定位、双荧光素酶报告系统检测病毒聚合酶活性等。

**研究结果**

**Piezo1在甲型流感病毒感染和复制中起关键作用**
通过检测A549细胞中Piezo1和Piezo2的基线表达水平，发现Piezo1高表达而Piezo2极低。利用CRISPR-Cas9分别敲低Piezo1或Piezo2，只有Piezo1敲低有效抑制IAV感染和复制。构建Piezo1敲除单克隆细胞系后，确认其增殖未受影响，但H1N1病毒在A549和BEAS-2B细胞中的传播显著降低。Piezo1选择性抑制剂GsMTx4以剂量依赖方式抑制IAV复制，而Piezo1过表达则促进病毒感染。Piezo1激动剂Yoda1预处理可显著促进IAV感染。

**蛋白质组学揭示Piezo1影响流感病毒内吞**
对Piezo1敲除A549细胞进行非标记定量蛋白质组学分析，结果显示Piezo1敲除导致细胞蛋白表达广泛重塑，基因集富集分析（GSEA）表明钙离子信号通路显著受影响。基因本体（GO）富集分析显示差异蛋白富集于钙黏蛋白结合、丝氨酸/苏氨酸激酶活性等类别；京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析提示内吞过程受影响。功能性验证表明，Piezo1敲除显著抑制H1N1病毒的结合和内吞，并抑制H5N1假病毒及PR8、H3N2等其他株系的进入。而双荧光素酶报告系统显示Piezo1敲除不影响病毒RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）活性，表明Piezo1主要影响早期进入阶段。

**Piezo1调控流感病毒感染期间的钙离子波动和F-actin聚合**
共聚焦显微镜确认Piezo1敲除抑制病毒结合和内化。时间点实验表明，GsMTx4在病毒生命周期初始阶段（结合和进入窗口期）给药才有效。流感病毒感染显著提高细胞内Ca²⁺水平，而Piezo1敲除、GsMTx4处理或胞内钙螯合剂BAPTA-AM均可抑制IAV诱导的钙内流。GsMTx4与BAPTA-AM联合应用产生协同抑制作用，几乎完全抑制病毒蛋白表达。此外，Piezo1敲除、GsMTx4处理或细胞骨架抑制剂细胞松弛素D（Cyto D）均显著抑制IAV诱导的F-actin聚合，并抑制病毒复制。

**Piezo1与HA的相互作用是间接的，且Piezo1敲除不影响细胞唾液酸化**
外源共表达Piezo1-Flag和HA-His后，共定位和免疫共沉淀（Co-IP）显示两者存在互作。但将Piezo1胞外域两个潜在N-连接糖基化位点（N295A和N2294A）突变后，突变体仍能与HA结合。细胞外pull-down实验显示纯化的Piezo1蛋白不能直接拉下HA蛋白。流式细胞术检测显示，Piezo1敲除不影响细胞表面α2,3-、α2,6-及总唾液酸水平。功能验证表明，突变型与野生型Piezo1同样能促进IAV感染、结合和进入。因此，Piezo1与HA的相互作用是间接的，且不依赖于其潜在唾液酸化位点或整体唾液酸水平。

**IP-MS鉴定HA与Piezo1之间的中间蛋白**
在A549细胞中共转染HA-His和Piezo1-Flag，分别用Anti-His和Anti-Flag抗体进行免疫沉淀，结合质谱分析并扣除IgG背景，与膜蛋白数据库交叉比对，筛选出9种候选膜蛋白：SDC1、MELK、MACF1、TMED10、ATP2A2、TMED9、GTF3C3、ESPL1和PTPRK。经功能筛选，敲低MELK、TMED9或GTF3C3显著抑制病毒结合，敲低MELK、TMED9、GTF3C3或ESPL1减少病毒进入。鉴于TMED9主要定位于内质网膜而非质膜，研究人员确定MELK为核心候选。构建MELK敲除A549单克隆细胞系后，Western blot和共聚焦显微镜证实MELK缺失几乎完全抑制IAV感染和复制。MELK特异性抑制剂OTS167在低至25 nM浓度时即几乎完全阻断IAV感染。

**MELK作为流感病毒的内吞受体并介导Piezo1与HA的相互作用**
Co-IP实验证实Piezo1和MELK均可分别与H1N1 HA蛋白相互作用，且MELK还能结合H5N1和H7N9亚型HA。共聚焦显微镜显示HA、MELK和Piezo1三者高度共定位。在293T细胞中，MELK-Flag可同时共沉淀HA-His和内源性Piezo1。细胞外pull-down实验证实MELK能直接结合HA，而Piezo1不能。在MELK敲除细胞中，Piezo1与HA的互作消失，表明MELK是两者结合不可或缺的中间分子。Anti-MELK多克隆抗体预处理细胞可有效抑制H1N1感染和复制。MELK敲除也显著减少H1N1病毒结合。以上证据表明MELK是流感病毒进入宿主细胞的关键内吞受体，并介导Piezo1与HA的互作。

**Piezo1与MELK相互作用并保护其免受泛素化介导的降解**
MELK敲除不影响Piezo1表达，但Piezo1敲除几乎完全抑制MELK蛋白表达（在A549和BEAS-2B细胞中均一致），而MELK mRNA水平反而升高。用蛋白酶体抑制剂MG-132处理Piezo1敲除细胞，可显著恢复MELK蛋白表达。泛素化实验表明，Piezo1敲除增强MELK的泛素化程度。通过PhosphoSitePlus数据库和AlphaFold3预测，Piezo1与MELK结合界面包含两个潜在泛素化位点K520和K536。因此，Piezo1通过结合MELK保护其免受泛素-蛋白酶体系统降解。

**Piezo1抑制剂GsMTx4有效保护小鼠免受流感感染**
在BALB/c小鼠中，以10 MLD50 H1N1病毒致死感染后，鼻腔给予不同剂量GsMTx4（0.75、1.5、3 mg/kg）或阳性对照扎那米韦。免疫印迹显示GsMTx4剂量依赖性降低肺组织中病毒PA蛋白丰度；免疫荧光显示病毒NP蛋白表达减少；H&E染色显示肺部炎性浸润和组织损伤减轻；病毒滴度测定显示肺病毒载量显著降低。体重监测和生存分析显示，GsMTx4处理显著缓解体重下降，高剂量组（3 mg/kg）存活率达到60%，而PBS组几乎全部死亡。

**肺特异性Piezo1敲除小鼠的研究**
构建II型肺泡上皮细胞特异性诱导型Piezo1敲除小鼠（Piezo1^fl/fl Sftpc-CreERT2），以10 MLD50 PR8毒株感染。免疫印迹确认肺组织Piezo1敲除成功，且病毒PA蛋白丰度显著低于对照。H&E染色显示敲除小鼠肺部病理损伤明显减轻；免疫荧光显示病毒NP荧光信号减弱；病毒滴度在第3天降低约50%，第5天仍维持约30%抑制。体重监测显示敲除小鼠从第8天起恢复更快，存活率达到53.85%，而对照组仅为7.69%。

**总结讨论与结论**

**讨论总结**：本研究揭示了Piezo1在呼吸道上皮细胞中的独特作用：它并非直接作为病毒受体，而是通过稳定MELK蛋白表达（防止其泛素化降解）以及发挥钙离子通道功能驱动F-actin聚合，从而双重调控流感病毒进入。虽然Piezo1在免疫细胞中可能参与抗病毒免疫，但在上皮细胞中却促进病毒入侵，这种组织特异性差异意味着全身性抑制Piezo1可能是一把“双刃剑”。未来需要开发能够特异性靶向呼吸道上皮细胞而不影响免疫细胞功能的Piezo1调控策略，以实现最佳的治疗效益-风险比。

**结论翻译**：总之，研究人员首次将MELK鉴定为流感病毒进入宿主细胞的内吞受体，并揭示了新型Piezo1-MELK功能轴在流感病毒进入中的核心作用。研究显示，抑制或敲除Piezo1可显著减少小鼠肺部的流感病毒复制。因此，抑制Piezo1将是一种有前景的宿主导向抗病毒策略。