模块化肝脏-微生物微流控平台用于评估微生物代谢物的治疗与不良效应

《Advanced Healthcare Materials》：A Modular Liver–Microbial Microfluidic Platform to Evaluate Therapeutic and Adverse Effects of Microbial Metabolites

　　

肠道微生物代谢物，特别是短链脂肪酸（short-chain fatty acids, SCFAs）如丁酸，在调节非酒精性脂肪肝病（non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD）中起重要作用。动物研究表明，产丁酸微生物可改善肝功能，但完全恢复受限于共生菌的意外副作用。这些潜在的生物分子机制尚不明确，因为缺乏能够系统检查工程微生物代谢物治疗效益及其潜在不良影响的体外共培养模型。为解决这一问题，研究人员开发了一种模块化微流控平台，用于研究活微生物代谢物对肝脂肪变性和肝功能的影响。研究人员创建了一种基于微流控的肝脂肪变性模型，并与分区微生物模块整合，便于研究活微生物产生的代谢物如何影响肝脏模型。研究人员比较了合成SCFA补充与对照及产丁酸大肠杆菌Nissle 1917（E. coli Nissle 1917, EcN）菌株共培养对肝脂肪变性的影响。研究结果显示，活微生物共培养并未完全模拟外源SCFA治疗。两种处理均减少了脂肪变性脂质积累，但活微生物诱导了炎症和肝脏代谢变化，提示其他微生物因子的贡献，强调在肝病治疗中需全面评估副作用。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**
非酒精性脂肪肝病（non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD）是一种以肝细胞内三酰甘油（triacylglycerol, TAG）过度蓄积为特征的慢性肝病，其发病与遗传、脂质过氧化、胰岛素抵抗及肠道微生物失调密切相关。肠道微生物代谢物，尤其是短链脂肪酸（short-chain fatty acids, SCFAs）如丁酸、乙酸和丙酸，在维持代谢稳态中发挥关键作用。动物实验表明，产丁酸微生物可改善肝功能，但完全恢复常受限于共生菌的意外副作用。目前，缺乏能够同时系统评估工程微生物代谢物治疗效益及其潜在不良影响的体外共培养模型。现有肠道-肝脏共培养模型多聚焦于肠上皮细胞对肝脂肪变性进展的调节，尚未直接建模与活体肠道微生物的相互作用。为此，研究人员开发了一种模块化微流控平台，将活体微生物与脂肪变性肝细胞通过共享循环培养基直接连接，以可控方式评估微生物代谢物的治疗与不良效应。论文发表在《Advanced Healthcare Materials》。

**关键技术方法**
研究人员采用以下主要技术：（1）微流控肝芯片制备：基于聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane, PDMS）复制模塑技术构建含微柱阵列的培养室，用于固定HepaRG（人肝祖细胞系）来源的肝球体；（2）微生物模块制造：通过聚碳酸酯（polycarbonate, PC）微铣加工形成微生物室和系统室，两室由黏蛋白-琼脂（mucin-agar）包被的多孔聚碳酸酯膜分隔，该膜允许代谢物扩散但阻止细菌易位；（3）动态循环共培养系统：使用定制微流控蠕动泵（流速约70 μL/h）将肝芯片与微生物模块连接，实现培养基再循环；（4）肝脂肪变性诱导：采用游离脂肪酸（free fatty acids, FFAs，100 μM油酸与50 μM棕榈酸结合牛血清白蛋白）动态灌注5天；（5）基因表达分析：通过定量PCR（quantitative PCR, qPCR）检测炎症因子、核受体及细胞色素P450（cytochrome P450, CYP450）酶的mRNA水平；（6）代谢物定量：采用气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS）测定丁酸和乙酸浓度。细胞来源：HepaRG祖细胞购自Biopredic International（法国），微生物菌株为大肠杆菌Nissle 1917（E. coli Nissle 1917, EcN）的两种营养缺陷型突变株（对照Ctrl-EcN和产丁酸工程菌But-EcN）。

**研究结果**

**2.1 肝脂肪变性芯片的建立**
通过将分化后的HepaRG肝球体接种至微流控芯片，并在动态灌注条件下使用FFA处理5天，成功建立了肝脂肪变性-on-chip模型。免疫荧光染色显示，FFA处理组肝细胞中脂滴积累较未处理组增加4.3倍（1196.6 μm³/细胞核 vs 272.1 μm³/细胞核），且细胞死亡率升高（33.9% vs 24.7%）。胰岛素刺激下，FFA处理组p-AKT/AKT比例未见显著变化，表明出现胰岛素抵抗，而未处理组p-AKT/AKT比例升高1.2倍。

**2.2 外源丁酸和乙酸对肝脂肪变性芯片的影响**
在FFA处理后，分别添加3 mM丁酸钠（sodium butyrate, NaB）或乙酸钠（sodium acetate, NaAc）处理48小时。两种SCFAs均显著减少脂滴积累：NaAc减少50%，NaB减少58.3%，且大脂滴（直径>5 μm）比例降低。但细胞活力无显著改变（碘化丙啶阳性细胞比例无差异），且胰岛素敏感性均未恢复（p-AKT/AKT比例无显著变化）。

**2.3 微流控微生物培养模块的开发与表征**
设计并制造了分区微生物模块，包含微生物室和系统室，由黏蛋白-琼脂包被的多孔聚碳酸酯膜分隔。染料扩散实验证明膜允许可溶性因子双向扩散；共聚焦显微镜证实绿色荧光蛋白（green-fluorescent protein, GFP）标记的野生型大肠杆菌不能穿透该膜。微生物模块可维持细菌生长48小时。在接种Ctrl-EcN和But-EcN 24小时后，系统室中分别检测到乙酸（1.62 mM）和丁酸（1.4 mM），而对方代谢物浓度可忽略。

**2.4 活微生物与脂肪变性肝组织的动态共培养**
将Ctrl-EcN或But-EcN与脂肪变性肝芯片动态共培养48小时。两种菌株均未显著影响肝细胞活力（PI阳性细胞比例与FFA处理组相似），但显著减少脂滴积累：Ctrl-EcN减少57.4%，But-EcN减少76.6%。然而，胰岛素抵抗未得到改善（p-AKT/AKT比例无显著变化）。

**2.5 活微生物共培养与外源SCFA补充对肝细胞炎症反应的比较**
通过qPCR分析炎症因子表达。FFA处理组较未处理组上调IL6（1.6倍）、IL8（2.64倍）和MCP1/CCL2（2.5倍），下调CXCL10（0.5倍）。外源NaB或NaAc对IL6和IL8表达无显著影响，但NaB显著降低MCP1/CCL2（-17.5倍），NaAc降低2.02倍。活微生物共培养则引发不同反应：Ctrl-EcN显著上调IL6（7.3倍）和IL8（4.2倍）；But-EcN仅上调IL8（2.9倍），同时显著上调CXCL10（5.9倍）并下调MCP1/CCL2（-1.5倍）。两种菌株培养物中均检测到低水平内毒素（<1 ng/mL），可能部分解释炎症反应。

**2.6 活微生物共培养与外源SCFA补充对肝细胞核受体和代谢功能的比较**
检测核受体转录因子和CYP450酶的mRNA表达。过氧化物酶体增殖物激活受体α（peroxisome proliferator-activated receptor-alpha, PPARα）在FFA处理组中下调3倍，NaB或But-EcN共培养可显著恢复其表达。肝脏X受体（liver X receptor, LXR）在FFA组中下调2.2倍，且不被任何处理恢复。孕烷X受体（pregnane X receptor, PXR）在FFA组中上调，外源SCFA或活微生物共培养均使其降至正常或更低水平。组成型雄烷受体（constitutive androstane receptor, CAR）在NaAc或活微生物共培养组中下调。维甲酸X受体α（retinoid X receptor-alpha, RXRα）在NaAc或Ctrl-EcN处理组中下调约1.9倍。CYP2E1表达与PPARα呈反向趋势：FFA组上调3.5倍，所有处理均显著下调（NaAc -22倍，NaB -3.8倍，Ctrl-EcN -29.5倍，But-EcN -15.2倍）。CYP7A1在FFA组中上调，被全部处理下调。CYP3A4、CYP1A2和CYP2C19在活微生物共培养组中受到更强烈的抑制，例如Ctrl-EcN使CYP3A4降低250倍，CYP1A2降低26倍，CYP2C19降低2.6倍。CYP2D6表达在所有条件下变化较小。

**讨论与结论**
讨论部分指出，该模块化微流控平台首次实现了活体微生物与脂肪变性肝细胞的实时共培养，克服了以往模型无法同时维持微生物和哺乳动物组织不同培养条件的难题。平台证明了外源SCFA与活微生物共培养对肝脂肪变性的效应并不完全一致：两者均减少脂质积累，但活微生物共培养额外诱导了炎症信号（如IL6、IL8升高）和CYP450酶的下调，这可能与低水平内毒素及其他微生物因子有关。研究强调，工程微生物治疗不能仅通过代谢物补充推断其效果，需全面评估对肝脏炎症和药物代谢功能的潜在不良影响。平台局限性包括缺乏肠上皮细胞屏障、厌氧环境和Kupffer细胞等非实质细胞，未来可纳入这些组分以提高生理相关性。结论部分翻译如下：本研究成功建立了微流控脂肪变性-on-chip模型，有效重现了脂质积累、肝脏炎症和胰岛素抵抗等关键脂肪变性表型。研究结果突出了SCFAs，特别是丁酸，在减轻FFA诱导的脂肪变性中的肝脏保护作用（减少脂质积累），但未能恢复胰岛素敏感性。虽然与产丁酸EcN共培养改善了脂肪变性，但也损害了异源物代谢CYP450酶，提示潜在的意外代谢效应。本研究是首批将活微生物共培养与脂肪变性肝细胞结合使用的实时体外模型之一，为微生物代谢物对肝脂肪变性的影响提供了宝贵见解。该平台表明，活微生物干预不能仅从代谢物补充推断，因此可能对代谢性肝病的工程微生物疗法的临床前评估具有重要价值。