结合UHPLC-MS/MS技术的干尿斑点法用于肌钙蛋白激活剂的分析

《Journal of Choice Modelling》：Dried Urine Spot Strategy Coupled with UHPLC-MS/MS for the Analysis of Troponin Activators

　　张晓云|徐宁|杨明学|李云达|黄晓晨|乔岩|李国军|连高奇•建立了基于DUS–UHPLC–MS/MS的方法用于检测尿液中的六种肌钙蛋白激活剂。•该方法具有高灵敏度、良好的线性度、精密度以及提取效率。•对DUS与液态尿成分进行了比较。•在6个月内，DUS的稳定性远优于液态尿。•这种简单的微量采样方法适用于快速反兴奋剂筛查。

引言
肌钙蛋白激活剂，也称为快速骨骼肌肌钙蛋白激活剂（FSTAs），是一类小分子化合物或生物制剂，它们能够特异性地与肌钙蛋白复合物结合，通过调节肌纤维中对钙离子的敏感性来增强肌肉收缩力。在肌细胞的肌浆环境中，肌钙蛋白-肌球蛋白调控复合物作为关键的钙传感器，精确调控肌动蛋白与肌球蛋白之间的相互作用，这是肌肉收缩与舒张的重要过程[1]。这一独特机制使得肌钙蛋白激活剂具有显著提升运动员最大摄氧量和运动耐力的潜力，因此也被视为体育领域中可能被滥用的提升表现的物质。由于其在提升运动表现方面的功效已被证实，类似肌钙蛋白激活剂的物质已被世界反兴奋剂机构（WADA）列入2024年禁用清单的S0类（未经批准的物质）[2]。该类别包括临床前和临床阶段的药物、已终止的临床试验药物、设计药物，以及仅获批用于兽医领域的物质，其中Reldesemtiv（CK-2127107）和Tirasemtiv（CK-2017357）是典型的肌钙蛋白激活剂代表。根据《世界反兴奋剂规则》，如果运动员的生物样本中存在任何禁用物质、其代谢物或相关标志物，即构成违反反兴奋剂规定。因此，反兴奋剂检测应同时针对母体禁用物质及其代谢衍生物，以实现全面检测。然而，作为新兴的体育兴奋剂，肌钙蛋白激活剂的检测面临着诸多挑战。目前，全球范围内关于肌钙蛋白激活剂检测技术的研究还相对较少，尚未建立标准化的全面检测体系。此外，肌钙蛋白激活剂在体内的半衰期较短，且代谢清除速度较快，这使得传统检测方法难以捕捉到其存在时间，进一步增加了反兴奋剂监测的复杂性。同时，针对肌钙蛋白激活剂的长期稳定性研究以及敏感、特异的定量检测方法也十分有限。综合这些不足，反兴奋剂检测领域存在亟需解决的技术缺口，亟需开发高效、可靠且灵敏的分析方法。

传统的反兴奋剂检测主要依赖液态生物样本（如全血、血浆和尿液），这类样本的处理需要较大的样本量，且在运输和储存过程中需要严格的温度控制，以防止易变化合物降解。这些要求大大增加了物流和保存成本，限制了反兴奋剂检测的效率和可及性，尤其是在偏远或资源匮乏的地区。相比之下，干基质采样（DMS）技术作为一种有前景的生物样本采集和保存替代方案，因其具有样本量少、储存和运输方便、减少采样侵入性从而提高伦理合规性等优势，已在多个研究领域受到越来越多的关注。近年来，DMS越来越多地应用于临床诊断、药物分析、食品安全检测以及反兴奋剂检测领域。DMS的核心操作是将少量生物样本（通常不超过100 μL）滴加在滤纸基底上，然后进行常温或可控条件下的干燥。DMS最初由Guthrie和Susi在1963年为新生儿血液采样和代谢疾病筛查而发明[3]，此后被广泛用于大规模新生儿血液分析，作为一种通过指尖采血的微创替代方案[[4], [5], [6]]。在过去几十年里，兼容DMS的生物基质范围不断扩展，包括血浆、尿液、唾液以及其他生物标本[[7], [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14]]，进一步拓宽了其应用范围。值得注意的是，与液态样本相比，干燥样本（如干燥血斑[DBS]和干燥尿斑[DUS]）对于大多数分析物而言具有更优异的稳定性。这些干燥样本可以存放在含有干燥剂的密封袋中，在室温下保存数周至数年（对于极不稳定的化合物，可在2–8°C或≤ ?60°C下保存），并且可以通过普通邮件运输。这些优势不仅降低了样本的储存和运输成本，还减少了处理液态生物样本时的感染风险[[15], [16]]。

多项研究已经验证了DMS在反兴奋剂检测中的分析可行性。在过去十年中，液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）和超高效液相色谱-串联质谱法（UHPLC-MS/MS）已被成功应用于检测DBS样本中的各种WADA禁用物质，包括红细胞生成素（EPO）等大分子物质[16]、小分子兴奋剂（如S3 β?-激动剂、S4激素和代谢调节剂、S5利尿剂和掩蔽剂）[[17], [18]]以及肽类[19]。作为最强大的分析工具之一，UHPLC-MS/MS凭借其高分离效率、快速分析速度和出色的灵敏度，在检测痕量物质方面具有独特优势，是现代反兴奋剂检测的核心技术。作为DMS的一个重要分支，DUS近年来也被越来越多地用于检测药物及其代谢物、霉菌毒素、氨基酸，以及用于疾病诊断[[20], [21], [22], [23], [24], [25], [26], [27], [28], [29]]。例如，先前关于大麻素及其代谢物的研究证实，DUS与液态尿检测结果具有良好的一致性，证明了DUS可作为传统液态尿采样的替代方案[28]。另一项研究则展示了DUS在早期诊断鞘脂代谢紊乱方面的高度可靠性，凸显了其在临床和法医实践中的巨大潜力[29]。尽管取得了这些进展，但DUS在反兴奋剂检测中的应用仍缺乏足够研究[[30], [31]]。据我们所知，目前尚未建立基于DUS与UHPLC-MS/MS联用的定量分析方法来检测肌钙蛋白激活剂。

在基于DMS的分析流程中，样品预处理是一个至关重要的步骤，因为它直接决定了检测结果的准确性、灵敏度和重复性。目前，DBS样本主要通过手工操作进行处理，包括穿刺、超声提取、液液萃取（LLE）和固相萃取（SPE）[32]。在进行LC-MS/MS或UHPLC-MS/MS分析之前，如有必要，还会进行衍生化处理以提高检测灵敏度。同样，DUS的预处理通常包括穿刺、LLE、针对蛋白质结合分析物的酶解、同位素稀释以及SPE，之后再进行UHPLC-MS/MS或LC-MS/MS检测。虽然基于LC-MS/MS和UHPLC-MS/MS的DMS分析方法已在疾病监测、临床前药物研发、毒理学、药代动力学和代谢组学等领域逐步建立并得到广泛应用[[33], [34]]，但它们在肌钙蛋白激活剂检测方面的应用仍然完全未被探索。

为填补上述研究空白，本研究旨在通过将DUS技术与UHPLC-MS/MS相结合，开发一种用于检测六种肌钙蛋白激活剂的灵敏且特异的定量方法。具体而言，对DUS预处理流程进行了系统优化和评估，全面筛选了提取溶剂、提取时间以及纯化条件等关键参数。此外，还从线性度、灵敏度、精密度、准确性、稳定性以及基质效应等方面对所建立方法的分析性能进行了全面验证。本研究旨在为这六种肌钙蛋白激活剂建立一种高效、可靠且实用的定量检测方法，为这类提升表现物质的反兴奋剂监测提供技术支持和方法学参考。同时，这项研究也进一步拓展了DMS和UHPLC-MS/MS技术在体育反兴奋剂分析领域的应用范围。

试剂与材料
乙腈、甲醇和乙酸乙酯（HPLC级）购自美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市的Fisher Chemical公司。超纯水由中国广州的 Watson’s Food & Beverage Co., Ltd.提供。Reldesemtiv、Tirasemtiv、GSK854和EMD57033的参考标准品（纯度>98%）购自美国马萨诸塞州波士顿的TargetMol公司。Nelutroctiv和RPI-194购自美国新泽西州的MCE公司。甲酸（LC-MS级）购自中国上海的Thermo Fisher Scientific公司。

干燥尿样

UHPLC-MS优化
在本研究中，直接采用了我们之前工作中已验证有效的色谱和质谱条件，以确保分析方法的可靠性和重复性。表1总结了这六种肌钙蛋白激活剂的MRM离子跃迁和关键质谱参数。所有参数均经过优化，以最大限度地提高每种分析物的灵敏度和选择性，这对于准确定量痕量肌钙蛋白至关重要。

结论
本研究建立了一种灵敏且可靠的DUS-UHPLC-MS/MS方法，并对其进行了全面验证，该方法可严格遵循WADA和FDA的分析指南，同时定量测定尿液样本中的六种肌钙蛋白激活剂。通过系统优化提取条件和仪器参数，所建立的该方法具有较高的提取效率、可接受的基质干扰、优异的线性相关性、良好的精密度和准确性。

CRediT作者贡献声明
张晓云：撰写——初稿、方法学、正式分析、数据整理。徐宁：验证、软件、方法学。杨明学：概念设计、软件、方法学。李云达：方法学、监督。黄晓晨：可视化、概念设计。乔岩：方法学。李国军：监督、概念设计、资金获取、方法学。连高奇：撰写——审阅与编辑、监督、资源协调、项目管理、研究实施、资金获取。

资金支持
本研究得到了河北省科技计划项目（编号246Z7772G）和河北省2025年度重点实验室自主研究项目（编号2025ZZ02）的支持。

声明
伦理审批。所有实验操作均严格遵循《人类尿液生物材料采集与处理国家标准》（GB/T 38735-2020）的要求，且已获得河北省体育科学研究所的批准（批准号LL2025001）。

CRediT作者贡献声明
张晓云：撰写——初稿、方法学、正式分析、数据整理。徐宁：验证、软件、方法学。杨明学：软件、方法学、概念设计。李云达：监督、方法学。黄晓晨：可视化、概念设计。乔岩：方法学。李国军：监督、方法学、资金获取、概念设计。连高奇：撰写——审阅与编辑、监督、资源协调、项目管理、研究实施、资金获取。

利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。