《Journal of Chromatography Open》：Optimization and Validation of a Sensitive Liquid Chromatography–Tandem Mass Spectrometry Method for the Simultaneous Quantification of Methotrexate and 7-Hydroxymethotrexate in Human Serum Using Hydrophilic Interaction Chromatography
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研究人员开发并部分验证了在人K2EDTA血清中同时定量甲氨蝶呤(MTX)及其主要代谢物7-羟基甲氨蝶呤(7-OH-MTX)的灵敏且选择性强的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)生物分析方法，该方法使用甲氨蝶呤-D3作为内标。色谱分离在Luna 5μ亲水相互作
研究人员开发并部分验证了在人K2EDTA血清中同时定量甲氨蝶呤(MTX)及其主要代谢物7-羟基甲氨蝶呤(7-OH-MTX)的灵敏且选择性强的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)生物分析方法，该方法使用甲氨蝶呤-D3作为内标。色谱分离在Luna 5μ亲水相互作用液相色谱(HILIC)柱上进行，采用Shimadzu UFLC系统结合Sciex API-4000三重四极杆质谱仪，在正电喷雾电离-多反应监测模式下运行。研究人员从250 μL血清中通过Strata-X C18固相萃取(SPE)柱提取分析物。总分析运行时间为2.08分钟。该方法在MTX的2.00–1001 μg/mL和7-OH-MTX的2.02–1020 μg/mL范围内呈线性，所有批次的决定系数(r2)均大于0.99。批内和批间精密度(%CV)及准确度(%标称值)在所有质量控制水平下均符合美国食品药品监督管理局(US FDA)和欧洲药品管理局(EMA)的接受标准。平均提取回收率分别为69.25%(MTX)和66.35%(7-OH-MTX)。内标归一化基质因子(在所有批次和质量控制水平下为0.89–1.04)证实了在包括溶血和脂血基质在内的八批血清中离子抑制或增强极小。该方法旨在用于大剂量甲氨蝶呤(HDMTX)治疗期间的早期药代动力学监测。将其应用于输注后48小时和72小时收集的九份患者血清样本表明，两个时间点之间的平均MTX和7-OH-MTX浓度下降了74%，这与预期的HDMTX消除动力学一致；虽然在48小时时有五分之九的患者在验证范围内可定量检测到7-OH-MTX，但在两个时间点MTX浓度均低于验证的下限定量限(LLOQ)，这表明本方法适用于早期(0–24小时)而非晚期消除监测。
该研究针对大剂量甲氨蝶呤(HDMTX)治疗期间亟需同步监测原型药物及其主要代谢物7-羟基甲氨蝶呤(7-OH-MTX)的临床痛点展开。在临床实践中，HDMTX常用于治疗急性淋巴细胞白血病等恶性肿瘤，其血药浓度可达数百μg/mL，远超低剂量治疗的ng/mL级别。传统的免疫分析法因MTX与7-OH-MTX之间存在显著的交叉反应，无法区分二者；而常规的反相液相色谱法则面临极性分析物保留不足的难题。此外，7-OH-MTX半衰期长，易在肾小管沉淀引发肾毒性，因此建立一种能在大范围浓度内同时准确定量二者的高灵敏度、高选择性方法，对于指导亚叶酸钙解救剂量调整及预防严重不良反应具有至关重要的临床意义。为此，研究人员开发了一种基于亲水相互作用色谱(HILIC)的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)方法，成功实现了对人血清中MTX和7-OH-MTX的同时快速定量。
为实现上述目标，研究人员采用了几项关键技术方法。首先，样本来源于接受HDMTX治疗的儿科肿瘤患者的K2EDTA血清。其次，样本前处理采用固相萃取(SPE)技术，有效去除了磷脂等基质干扰并保护了HILIC色谱柱。在色谱分离上，创新性地选用Luna 5μ HILIC柱，通过等度洗脱实现了极性分析物的高效保留与快速分离。最后，检测端使用Sciex API-4000三重四极杆质谱仪，采用正电喷雾电离(ESI)和多反应监测(MRM)模式，并引入甲氨蝶呤-D3作为同位素内标(IS)以校正系统误差。
方法开发与色谱选择性
研究人员通过对比发现，传统的C18反相柱难以保留MTX(logP ?1.85)等强极性两性离子分析物。因此，选用HILIC柱，利用其亲水分配和静电相互作用机制，成功在2.08分钟内完成了基线分离。特异性评估覆盖了溶血和脂血等复杂基质，结果显示无任何内源性物质在分析物保留时间处产生干扰，证明了该方法极强的抗基质干扰能力。
线性、校准曲线与灵敏度
研究人员建立了涵盖广泛临床暴露窗口的8点校准曲线。MTX和7-OH-MTX的线性范围分别达到2.00–1001 μg/mL和2.02–1020 μg/mL，决定系数(r2)均大于0.99。下限定量限(LLOQ)确认为2.0 μg/mL，信噪比(S/N)大于5，准确度和精密度完全符合监管标准，满足了从早期输注峰值到关键24–48小时监测点的宽动态范围需求。
精密度与准确度
通过三个精密准确性质控(PA)批次的评估，研究人员证实该方法具有极高的可靠性。在低限质控(LOQQC)、低质控(LQC)、中质控(MQC)和高质控(HQC)水平下，MTX和7-OH-MTX的批内和批间变异系数(%CV)及准确度(%标称值)均满足FDA和EMA的严格要求，证明了方法的稳健性。
提取回收率与基质效应
尽管平均提取回收率约为66%–69%，但在不同质控水平上表现一致。关键的基质效应评估显示，内标归一化基质因子在0.85–1.15的理想范围内，且变异系数(%CV)小于15%。这证实了SPE-HILIC流程能有效屏蔽来自不同供体血清的离子抑制或增强效应。
自动进样器残留
研究人员评估了高浓度样品对后续低浓度样品的潜在影响。结果显示，MTX的残留量为LLOQ信号的7.63%，7-OH-MTX无残留。虽然符合法规标准，但研究建议在常规临床检测中，高浓度样品后注射空白样本以规避潜在的假阳性风险。
耐用性
由第二位分析人员独立操作同一仪器条件进行验证，结果与首批次高度一致，证实了该方法在不同操作人员间的稳定重现能力。
应用于现存患者血清样本
将该方法应用于9例患者的真实样本发现，在输注后48小时和72小时，MTX浓度均降至LLOQ以下，而7-OH-MTX在部分样本中仍可定量。这一结果不仅验证了MTX和7-OH-MTX浓度随时间推移下降约74%的预期消除动力学，也客观界定了该方法的适用边界：即更适合于早期(0–24小时)血药浓度较高的监测阶段，而非晚期消除阶段。
综上所述，本研究成功开发并部分验证了一种基于HILIC的LC-MS/MS新方法，用于同步定量人血清中的MTX和7-OH-MTX。该方法具有运行时间短、线性范围宽、抗干扰能力强等显著优势。尽管受限于部分验证的性质，尚未完成全面的稳定性测试，但其在真实临床样本中的应用展示了巨大的潜力。该研究不仅丰富了HDMTX治疗药物监测(TDM)的工具箱，也为未来开展全面的验证工作奠定了坚实的理论与技术基础，有望为临床医生提供更精准的决策依据，从而优化治疗效果并降低毒副作用。
