《Journal of Colloid and Interface Science》：Myelin basic protein binding is modulated by leaflet asymmetry and lipid composition
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胡里奥·M·普斯特拉|亚历山德罗斯·库齐乌巴斯|尼科洛·帕拉奇尼|菲利普·古特弗罗因德|马克西米利安·W.A. 斯科达|斯蒂芬·霍尔|伊戈尔·格拉夫·冯·韦斯塔普|伊琳娜·阿帕纳森科|萨宾·迪卢韦特|吉列尔莫·贝尔特拉莫|玛丽娜·卡涅斯|斯蒂芬·福尔斯特|安德烈亚斯·M. 斯塔德
胡里奥·M·普斯特拉|亚历山德罗斯·库齐乌巴斯|尼科洛·帕拉奇尼|菲利普·古特弗罗因德|马克西米利安·W.A. 斯科达|斯蒂芬·霍尔|伊戈尔·格拉夫·冯·韦斯塔普|伊琳娜·阿帕纳森科|萨宾·迪卢韦特|吉列尔莫·贝尔特拉莫|玛丽娜·卡涅斯|斯蒂芬·福尔斯特|安德烈亚斯·M. 斯塔德勒
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基于硅的不对称髓鞘双分子层能够呈现真实的脂质复杂性。
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利用氘代脂质示踪剂的中子反射测量技术可解析膜片层的不对称性。
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接近天然的不对称髓鞘膜具有更高的髓鞘碱性蛋白覆盖度。
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热诱导的脂质重分布或对称双分子层会显著降低蛋白质吸附量。
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双分子层接触会压缩蛋白质；而模拟疾病的脂质则会增加膜层间距。
引言
生物膜在维持细胞完整性、实现信号转导以及调节代谢过程方面起着核心作用。要深入理解膜成分的物理化学性质及其与周边膜蛋白和整合膜蛋白的相互作用，对于阐明生理功能及疾病背后的分子机制至关重要。在诸多与膜结构异常相关的病理现象中，涉及髓鞘降解的神经退行性疾病因其复杂性以及对人类健康和疾病的重大影响而尤为突出[1]。
髓鞘是一种多层脂质膜，它包裹着中枢神经系统和周围神经系统中的神经元轴突，既起到电绝缘作用，又有助于动作电位的快速跳跃式传导[2]。髓鞘中含有多种脂质，这些脂质在头基化学结构、酰基链长度以及饱和度方面存在差异。胆固醇在髓鞘中也含量丰富，约占髓鞘总质量的35％[3]。胞质面朝向轴浆，而周质面则面向细胞外环境；这两层膜在脂质组成上存在差异，从而导致明显的双分子层不对称性[4]。
长期以来，人们一直通过X射线技术等手段对体内髓鞘的结构进行深入研究[5]、[6]。这些研究表明，在适当的冷冻保护条件下，髓鞘的超微结构能够得到几乎无损的保存，从而使紧密堆积的天然状态膜相与松散状态膜相能够在髓鞘中共存。此外，人们还利用各种模型膜方法对从活体生物中提取的纯化髓鞘膜进行了广泛研究[7]、[8]、[9]。
近年来，研究方向逐渐转向那些能更精准地模拟天然髓鞘脂质复杂性和膜片层不对称性的仿生系统[10]、[11]。这类模型被用来模拟健康状态和病理状态，例如通过使用来自多发性硬化症标准动物模型——实验性自身免疫性脑脊髓炎的相关脂质组成来开展研究。
髓鞘的紧密堆积依赖于髓鞘碱性蛋白，这种蛋白质能够固定少突胶质细胞膜中相对的胞质面，并有助于维持紧密堆积的髓鞘结构[12]。因此，人们已经在能够再现胞质面髓鞘界面关键特征的脂质体和支持型双分子层系统中研究了MBP与膜之间的相互作用[13]、[14]、[15]。这些研究表明，脂质组成会影响膜对蛋白质的反应。具有与疾病相关的脂质特征的膜更容易出现由MBP引发的不稳定性，包括紧密堆积结构的破坏，其表现与脱髓鞘现象类似[16]、[17]。在我们团队进行的SAXS和SANS实验中，MBP会导致天然胞质面髓鞘囊泡和经EAE处理的髓鞘囊泡发生聚集，但只有具有天然脂质组成的囊泡才能随着时间形成多层结构[18]。此外，天然胞质面髓鞘膜与MBP的结合强度也高于经过EAE处理的膜，因为后者 的弯曲刚度更低[18]、[19]、[20]、[21]、[22]。因此，MBP的结合作用不能仅仅归因于表面电荷。在类髓鞘系统中，这种相互作用还取决于鞘磷脂/胆固醇带来的堆积效应以及膜的力学特性[23]、[24]。
然而，目前的大部分研究都集中在对称的胞质面模型上，因此跨膜脂质不对称性对MBP吸附作用的具体影响尚不明确。由于髓鞘的特殊结构，很难区分两层膜各自的贡献以及它们与MBP之间的相互作用。而通过独立调控两层单分子层的组成，各类膜片层不对称的模型膜——从不对称脂质体、巨型单层囊泡到支持型双分子层——为解决这一问题提供了可控的研究途径[25]、[26]、[27]、[28]、[29]、[30]、[31]。这一领域的研究也在逐步揭示跨膜不对称性如何改变双分子层结构并调控膜与蛋白质之间的相互作用[32]、[33]。最近的研究还表明，膜片层不对称性可能会影响蛋白质的插入过程[34]、肽的活性[35]以及膜蛋白的折叠过程[36]，这说明即便整体双分子层组成保持不变，脂质的跨膜分布仍可能具有功能性意义。不过，对于多组分混合物而言，目前对这些效应的定量机制理解仍然有限。
在本研究中，我们结合了朗缪尔-布洛杰特技术和朗缪尔-谢弗技术，在硅基底上制备出了平面型的不对称髓鞘膜。在胞质面层中引入诸如d45-胆固醇这样的氘代脂质，使得中子反射测量实验中的对比度发生变化，从而能够分辨出双分子层组成上的细微差异。克利夫顿等人也曾采用类似的方法[37]，研究革兰氏阴性细菌外膜仿生模型中的不对称性效应。他们利用中子反射测量技术，探究了天然髓鞘和经EAE处理的不对称髓鞘与MBP相互作用时，垂直于界面的结构会发生怎样的变化。此外，他们还在不同温度下测试了这种不对称性的稳定性，并将其与对称胞质面髓鞘膜在蛋白质结合亲和力方面的表现进行了比较。最后，当在不对称的SMB-MBP系统上再沉积一层双分子层后，研究人员还对其垂直于平面的结构进行了表征。
这些研究结果为我们提供了新的见解，有助于了解脂质复杂性和膜不对称性是如何调控MBP与髓鞘之间相互作用的，从分子层面为研究脱髓鞘现象以及人类健康与相关疾病提供了重要依据。
章节摘要
材料
本研究中使用的仿生髓鞘膜是由美国阿拉巴马州阿尔巴斯特市Avanti Polar Lipids公司提供的天然猪脑脂质提取物制成的：Brain PC（840053）、Brain PE（840022）、Brain PS（840032）、Brain SM（860062）、Cerebrosides（Brain）（131303）以及Sulfatides（Brain）（131305）。胆固醇则是单独购买的，为Sigma品牌的胆固醇（Sigma-Aldrich，产品编号C8667，纯度≥99%）。由于这些脑源脂质属于天然提取物，每一种脂质类别本身都是多种成分的混合物
结果与讨论
为了高精度地阐明MBP与SMB之间的相互作用，我们采用了中子反射测量技术。该技术对垂直于膜平面的原子组成变化具有极高的灵敏度，能够以亚纳米级的分辨率重建深度分辨的SLD谱图。在镜面反射条件下——即入射角等于反射角——测得的强度可以直接反映膜的分层结构及其组成情况
结论
据我们所知，这是首项致力于设计具有真实髓鞘样脂质复杂性的硅支撑不对称膜的研究，这类膜为分析膜片层在膜与蛋白质相互作用中的作用提供了新的研究平台。我们的实验表明，膜不对称性并非髓鞘双分子层结构中的中性特征，而是决定性因素，它会影响髓鞘碱性蛋白与膜之间的相互作用。
借助中子技术
CRediT作者贡献说明
胡里奥·M·普斯特拉：撰写原文初稿、数据可视化、方法设计、实验实施、正式分析、数据整理、概念构建。亚历山德罗斯·库齐乌巴斯：撰写文章的审阅与编辑工作、实验验证、实验实施、正式分析。尼科洛·帕拉奇尼：撰写文章的审阅与编辑工作、实验所需资源准备、实验实施、数据整理。菲利普·古特弗罗因德：撰写文章的审阅与编辑工作、实验所需资源准备、实验实施、数据整理。马克西米利安·W.A. 斯科达：撰写文章的审阅与编辑工作、实验所需资源准备、实验实施、数据
资金支持
本研究得到了位于德国于利希研究中心的塔索·施普林格奖学金项目（J.M.P.）的支持。
利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
致谢
作者衷心感谢英国迪德科特的ISIS中子与μ子源所拥有的INTER中子反射仪，以及法国格勒诺布尔劳厄-朗之万研究所所拥有的FIGARO中子反射仪，这些设施为作者开展中子散射实验提供了宝贵的实验时间。此外，澳大利亚政府通过国家协作研究基础设施战略也为作者使用澳大利亚国家氘代设施提供了支持。作者还要感谢软凝聚态物质研究合作伙伴关系组织（PSCM，由ILL/ESRF牵头
