内在蛋白无序性与细菌特异性蛋白水解系统共同塑造发酵骆驼乳肽组

《Journal of Dairy Science》：Intrinsic protein disorder and bacteria-specific proteolytic systems shape the peptidome of fermented camel milk

　　

本研究考察了由嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus，St）、德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus，Lb）和瑞士乳杆菌（L. helveticus，Lh）发酵的骆驼乳肽组（peptidome）。采用基于液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）的肽组学（peptidomics）对3个生物学重复的肽谱进行分析，并使用 MaxQuant 软件进行定量。主要肽前体β-酪蛋白（β-casein）、αS₁-酪蛋白（αS₁-casein）和乳磷蛋白（lactophorin）表现出较高水平的内在无序性（intrinsic disorder），从而增强了其对酶促水解的易感性。St 发酵样品显示出更多的肽数量，但其多样性低于 Lb 和 Lh 发酵样品。Lh 发酵样品所含肽段短于 St 和 Lb 发酵样品。来源于 St 和 Lb 的肽分别更频繁地起源于前体蛋白的N端和C端区域，而 Lh 发酵则在蛋白中央区域表现出显著水解。若干肽段对应于先前报道的血管紧张素转化酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）抑制肽和二肽基肽酶-Ⅳ（dipeptidyl peptidase-IV，DPP-IV）抑制肽序列。总体而言，将蛋白内在无序性与细菌蛋白水解专一性相结合，有助于加深对不同食品蛋白蛋白水解过程的理解并优化其筛选。

该文发表于《Journal of Dairy Science》，聚焦发酵骆驼乳中肽组形成机制的解析。研究背景在于，骆驼乳因其潜在抗癌、抗糖尿病及肠道健康促进作用而受到广泛关注，其中生物活性肽被认为是重要功能成分之一。然而，现有研究虽然已提示不同发酵菌株可显著改变骆驼乳代谢物组成与蛋白水解强度，但基于非靶向代谢组学的结果难以精确解析肽段序列、前体蛋白来源及切割位点分布，因此尚不能从机制层面阐明“何种蛋白更易被降解”以及“不同乳酸菌如何形成菌株特异性肽谱”。在此背景下，研究人员围绕嗜热链球菌（St）、德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lb）和瑞士乳杆菌（Lh）发酵骆驼乳后形成的肽组开展系统比较，进一步将蛋白内在无序性（intrinsic disorder）这一结构属性与细菌蛋白水解系统特征进行整合分析，以解释发酵过程中肽段生成的规律。研究表明，底物蛋白的结构柔性与发酵菌的蛋白水解专属性共同决定了最终肽组特征；其中，Lh 表现出最广泛且最多样的蛋白水解活性，产生更多短肽并富集若干与 ACE 抑制和 DPP-IV 抑制相关的已知序列。这一发现为根据目标功能选择发酵剂、开展精密发酵（precision fermentation）定向生产功能肽提供了概念框架。

研究人员采用的主要技术方法包括：以阿联酋 Al-Ain 牧场来源低脂骆驼乳为样本基质，分别接种 St、Lh 和 Lb 发酵，并设置3个独立生物学重复；随后提取并纯化肽段，采用 LC–MS/MS 进行检测，以 MaxQuant 和 Andromeda 搜索引擎完成肽段鉴定与定量，数据库检索基于 UniProt 骆驼乳蛋白序列，筛选标准为假发现率（false discovery rate，FDR）≤1%；在数据分析层面，结合主成分分析（PCA）、层次聚类、Pearson 相关分析、单因素方差分析和二元 Logistic 回归；同时利用 IUPred2A 预测蛋白内在无序区，并参考 AlphaFold 的 pLDDT 置信度剖面辅助解释结构柔性与切割概率之间的关系。

Peptidome identification
研究人员利用 LC–MS/MS 对3类发酵骆驼乳样品的肽谱进行了系统鉴定，共检测到4,686条肽。结果显示，St 发酵样品中鉴定到的肽总数最多，说明其能够从骆驼乳蛋白中释放大量肽段；但从独特肽数量看，Lh 生成的特异性肽明显更多，提示其蛋白水解产物具有更高的序列异质性。该结果说明，单纯的肽数量并不能代表蛋白水解复杂度，不同菌种在肽组层面存在显著差异。

Principal component analysis (PCA)
主成分分析显示，PC1 解释了40.9%的总变异，PC2 解释了25%的总变异，累计解释率为65.9%。各菌种的3个重复样本均紧密聚类，表明实验重复性良好。Lh 发酵样品沿 PC1 与 St、Lb 明显分离，而 St 与 Lb 在 PC2 上较接近，提示二者肽组成存在一定相似性，但仍可区分。留一交叉验证（LOOCV）得到 Q²=0.61，轮廓系数为0.94，进一步支持分组区分的稳健性。研究人员据此认为，样本间分离主要源于菌种特异性的肽组成差异，而非仅仅是肽数量差异。该结果与不同菌株具有不同细胞包膜蛋白酶和胞内肽酶体系的事实相一致，其中 Lh 拥有多种 PrtH 家族蛋白酶及胞内肽酶，因此更易生成更短、更复杂的肽谱。

Hierarchical cluster analysis
热图分析显示，3类发酵样品在肽段分布和相对丰度方面具有明显异质性；同组生物学重复之间高度聚类，进一步说明数据稳定可靠。相关性热图也显示组内重复具有较强相似性，而不同菌种组之间存在清晰分离。由此可见，PCA 中观察到的差异具有真实生化基础。研究人员据此总结，Lh 形成的肽谱较 St 和 Lb 更复杂，这与其更强的细胞包膜蛋白酶和胞内肽酶联合作用相符，能够发生更深入的二级水解，产生更多短肽与异质肽。

Distribution of peptide lengths
肽长分布结果表明，所有鉴定肽段长度范围为6–42个氨基酸残基，主要集中于8–22残基。Lh 发酵样品中短肽，尤其是6–14残基的肽，显著更多，而较长肽较少；相比之下，St 和 Lb 更倾向于产生中长肽。该结果与前期代谢组学观察到的 Lh 能产生更多游离氨基酸和短肽的现象一致，说明 Lh 的蛋白水解过程更彻底。研究指出，短肽的形成有助于提高潜在生物可及性，但肽长本身并不能直接证明其在消化道中的稳定性，这仍取决于序列组成、疏水性、电荷及 Pro 等耐酶切残基的存在。

N-terminal and C-terminal amino acids
通过比较肽段N端与C端氨基酸分布，研究人员揭示了不同菌种的连续切割偏好。St 发酵样品中，以 Phe、Ile、Leu、Val 和 Lys 开头的N端肽更丰富，表明其在蛋白N端区域切割活跃。Lh 发酵样品中，Asp、Glu、Gly、His、Met、Asn、Gln、Ser、Thr 和 Trp 位于C端的肽更多，显示其在释放具有特定末端组成肽段方面更突出。Lb 则主要产生N端含 Leu、Val，且C端含 Lys、Arg 的肽。研究还指出，某些N端支链疏水残基及C端疏水/芳香族残基与 ACE 抑制活性增强有关，而靠近N端的 Pro、Ala、Val 或 Ile 常与 DPP-IV 抑制相关，因此这些末端组成差异具有潜在功能意义。

Precursor proteins
前体蛋白分析显示，β-酪蛋白是最主要的肽来源，其次为 αS₁-酪蛋白和乳磷蛋白（lactophorin，亦称 GLYCAM-1 或 PP3）。与其他菌相比，St 产生了最多来源于 β-酪蛋白和 αS₁-酪蛋白的肽；而 Lh 发酵样品中来源于乳磷蛋白的肽数量更多。κ-酪蛋白、αS₂-酪蛋白、α-乳白蛋白和血清白蛋白贡献的肽相对较少。研究据此说明，酪蛋白尤其是 β-酪蛋白，因结构开放而成为乳酸菌蛋白酶的优选底物；同时，乳磷蛋白尽管丰度较低，却是一个重要的肽前体，提示其在发酵骆驼乳中可能是值得关注的功能肽来源。

Cleavage sites preference in the major camel milk proteins
对主要骆驼乳蛋白切割位点的分析显示，发酵过程中在细菌蛋白酶和骆驼乳内源酶共同作用下发生了广泛断裂，生成大量重叠肽并实现较高序列覆盖度。St 发酵时，β-酪蛋白主要在N端16–49位和中央99–140位区域被切割；αS₁-酪蛋白和乳磷蛋白也呈现类似趋势，说明 St 主要释放中等长度肽。Lh 则主要靶向蛋白中央区域的切割位点，在乳磷蛋白来源肽中，Leu 和 Ile 常见于N端切割位点，而 Arg 和 Lys 更常见于C端。研究人员指出，Lh 对蛋白中央区域的偏好，与其能够释放如 IPP 等生物活性肽的能力一致。总体而言，不同菌株在底物蛋白不同区域表现出显著差异化的切割模式：St 更偏N端，Lb 更偏C端，Lh 更偏中央区域。

Discussion
讨论部分综合指出，3种乳酸菌在骆驼乳中的肽组差异，本质上反映了其蛋白水解系统组成与专一性的差别。St 虽然产生肽总数最高，但肽段整体较长，序列多样性较低；Lh 则生成最短且最具独特性的肽群，其 PCA 分离更多反映肽多样性而非肽数目。机制上，乳酸菌通常首先依赖细胞包膜丝氨酸蛋白酶（Prt enzymes）将乳蛋白水解为寡肽，再通过转运和胞内肽酶进一步降解。St 主要依赖 PrtS，以及 PepS、PepN 等氨肽酶，因此更擅长N端连续切割；Lb 具有 PrtB 及相关胞内肽酶，更倾向形成富集C端来源的肽；Lh 则拥有多种 PrtH 家族酶及丰富的胞内肽酶，能对 αs₁-、β-和 κ-酪蛋白的N端、C端及中央区域进行更广泛切割，产生大量短肽和重叠肽。

论文进一步将蛋白结构属性引入解释框架。β-酪蛋白、αS₁-酪蛋白及乳磷蛋白被预测为高内在无序蛋白，其 IUPred2A 无序评分较高，且 AlphaFold 预测局部距离差异检验（predicted local distance difference test，pLDDT）值较低，表明其结构更柔性、更少折叠。相对地，α-乳白蛋白和乳铁蛋白呈现高有序球状构象。二元 Logistic 回归结果显示，氨基酸残基的切割概率与无序评分呈正相关，即越无序的区域越容易被蛋白酶切割。研究人员据此指出，β-酪蛋白N端的磷酸丝氨酸簇、负电荷残基，以及 αS₁-酪蛋白N端多磷酸化位点和富 Pro 基序，可阻碍紧密二级、三级结构形成，从而提高柔性与酶可及性。乳磷蛋白虽然在乳中含量不高，但其N端和C端存在明显无序区，因此在发酵中也表现出较高蛋白水解敏感性，成为重要肽前体。

在生物活性层面，研究检出了多条与文献中 ACE 抑制和 DPP-IV 抑制活性相对应的肽序列。Lh 发酵样品中此类候选肽更多，符合其强蛋白水解系统易释放富 Pro 生物活性酪蛋白肽的特点。研究同时强调，这些功能关联目前主要基于文献比对，尚需直接活性验证。

研究结论可译为：本研究表明，骆驼乳蛋白在发酵过程中的蛋白水解受到底物蛋白内在结构无序性和发酵细菌特异性蛋白水解系统的共同塑造。高度无序的蛋白，尤其是 αS₁-酪蛋白、β-酪蛋白和乳磷蛋白，可能更易受到酶切，支持结构柔性促进细菌蛋白水解的观点。因此，尽管乳磷蛋白在乳中的相对丰度较低，其产生的肽数量和丰度仍相当可观。就发酵剂而言，L. helveticus 表现出最广泛且最多样的蛋白水解活性，其特征为偏向中央区域切割，并富集含有既往与 ACE 和 DPP-IV 抑制活性相关基序的短肽。相比之下，S. thermophilus 和 L. bulgaricus 表现出较为有限且区域特异性的切割行为，从而形成不同的肽谱。对蛋白内在无序性与细菌蛋白水解专属性相互作用的整合理解，为合理选择发酵剂提供了概念框架，并可支持未来开发面向多类食品基质、用于生产潜在功能性和营养性肽的精密发酵策略。研究同时指出，其局限性包括 LC–MS/MS 检测偏倚、肽组覆盖不完全及数据库偏倚等，且关于 ACE 与 DPP-IV 抑制作用的推断仍需后续直接验证。