奶牛相关变量、蛋白含量及巴氏杀菌对牛乳中蛋白酶活性的影响

《Journal of Dairy Science》：Influence of cow-associated variables, protein content, and pasteurization on protease activities in bovine milk

　　

研究人员测定了41头个体奶牛乳样中的纤溶酶(plasmin)、组织蛋白酶D(cathepsin D)、组织蛋白酶B(cathepsin B)和三肽氨基肽酶(tripeptide aminopeptidase)活性，并对生乳及对应的高温短时(HTST, 72°C, 15 s)巴氏杀菌乳分装样品在37°C下分别孵育0、1和7天。同时，研究人员考察了体细胞数(SCC)、泌乳天数(DIM)、胎次(LN)和蛋白含量与各蛋白酶活性之间的关联。在新鲜生乳中，SCC与三肽氨基肽酶和组织蛋白酶B活性呈正相关，但与纤溶酶或组织蛋白酶D活性无显著相关性。相比之下，纤溶酶活性与LN呈正相关，而与DIM无明显关联。蛋白含量与三肽氨基肽酶活性呈正相关。在37°C孵育期间，4种蛋白酶在7天内的活性均显著下降。HTST巴氏杀菌在0天显著降低了所有4种蛋白酶的活性，尽管降低程度因酶而异。三肽氨基肽酶和组织蛋白酶B表现出高度的热敏感性，其活性分别降低了97.9%和94.0%。组织蛋白酶D表现出中等耐热性，降低了77.0%；而纤溶酶仅表现出中等热敏感性，巴氏杀菌后活性仅下降了45.9%。随后在巴氏杀菌乳孵育期间，各酶的行为也存在差异。三肽氨基肽酶活性在整个孵育期间均保持极低水平，表明热处理使其几乎完全失活；组织蛋白酶B和D的活性在孵育期间持续下降。相比之下，纤溶酶活性在巴氏杀菌乳孵育期间显著增加，到第7天时上升了约131%。总体而言，这些发现凸显了牛乳蛋白水解系统的复杂性，并证明奶牛相关因素和热加工对不同蛋白酶的影响存在显著差异，这种蛋白水解平衡的改变可能对乳制品质量和货架期产生潜在影响。

本研究发表于《Journal of Dairy Science》。牛乳中的蛋白酶系统十分复杂，包含来自动物和微生物的内源性与外源性酶类。内源性蛋白酶可通过乳腺从血浆进入乳汁、由体细胞释放或与乳脂球膜相关。这些蛋白酶影响着牛乳中的蛋白水解程度，进而影响乳品质量、功能特性和感官属性。以往的研究多集中于单一蛋白酶或单一因素，关于奶牛相关变量、乳成分、热处理与孵育对多种蛋白酶系统综合影响的认知仍较匮乏。基于此，本研究旨在量化个体奶牛乳中的蛋白酶活性，探究其与SCC、DIM、LN及蛋白含量的关系，并评估HTST巴氏杀菌及后续孵育对这些活性的影响。

在关键技术方法方面，研究人员采集了41头荷斯坦-弗里生奶牛的单次乳样，覆盖了不同的SCC、DIM和LN水平。样本分为生乳组和经模拟HTST（72°C，15秒）处理的巴氏杀菌乳组，两组均在37°C下添加叠氮化钠抑制微生物生长后进行为期7天的孵育。在0、1和7天取样，通过超速离心获取上清液。研究人员采用荧光分析法分别测定了纤溶酶、组织蛋白酶D、组织蛋白酶B和三肽氨基肽酶的活性。统计分析则使用Python及其相关库，通过Pearson相关系数和配对t检验来评估变量间的关联及巴氏杀菌的即时效应。

研究结果显示：

生乳中的内源性蛋白酶活性

在0天时，生乳中测得的4种内源性蛋白酶均表现出显著的个体间变异性。其中，组织蛋白酶B的变异系数最高（72%），其次是纤溶酶（62%）和三肽氨基肽酶（52%），而组织蛋白酶D相对最为稳定（25%）。在0天的生乳中，纤溶酶与三肽氨基肽酶、组织蛋白酶B与组织蛋白酶D之间存在弱至中等的正相关，但各酶总体上表现为独立调节。

奶牛相关因素与蛋白酶活性的关联

Pearson相关性分析揭示了酶特异性的关联模式。组织蛋白酶B与SCC呈强正相关（r = 0.60），是数据集中最强的单项关联。三肽氨基肽酶与SCC（r = 0.35）和乳蛋白含量（r = 0.48）均显著相关。纤溶酶活性与LN呈正相关（r = 0.32）。值得注意的是，组织蛋白酶D活性与所考察的任何牧场水平因素均无显著相关性。

巴氏杀菌对蛋白酶活性的影响

HTST巴氏杀菌显著降低了所有4种蛋白酶在0天的活性，但酶之间的热敏感性层级分明。热敏感性由高到低依次为：三肽氨基肽酶（降低97.9%）、组织蛋白酶B（降低94.0%）、组织蛋白酶D（降低77.0%）和纤溶酶（降低45.9%）。

37°C孵育期间的蛋白酶活性

在37°C孵育的生乳中，所有4种蛋白酶的活性在7天内均显著下降。然而，在巴氏杀菌乳中，各酶的行为截然不同。纤溶酶表现出截然不同的动态变化，其活性在7天内增加了约131%，最终超过了生乳中的水平。其余3种酶在巴氏杀菌乳中持续下降或保持极低水平，其中三肽氨基肽酶在检测限附近。

在讨论部分，研究人员指出，本研究评估了奶牛相关变量、蛋白含量、巴氏杀菌和贮藏对个体奶牛乳中4种内源性蛋白酶的综合影响。个体间的巨大变异性通常在大宗乳研究中被掩盖，但这可能具有实际意义，即单头高蛋白酶活性奶牛可能会不成比例地影响大罐乳的质量。SCC与组织蛋白酶B和三肽氨基肽酶的最强正相关，暗示后者可能作为早期乳腺炎症的指标，值得作为亚临床乳腺炎潜在生物标志物进行研究。纤溶酶与LN的正相关证实了高龄奶牛体内纤溶酶水平较高。在孵育期间，生乳中蛋白酶的显著下降提示了渐进性的酶失活，可能涉及自溶机制。而在巴氏杀菌乳中，纤溶酶抑制剂的选择性热失活使得纤溶酶活性在贮藏期间大幅上升，改变了蛋白水解平衡。

结论部分指出，据研究人员所知，这是首项全面评估奶牛相关变量、乳成分和加工条件对不同蛋白酶活性综合影响的研究。结果表明，个体蛋白酶与不同的奶牛相关和乳质量指标相关联，这意味着乳蛋白酶系统并非由单一生物学因素控制。这些酶对HTST巴氏杀菌和随后的孵育反应各异，部分蛋白酶几乎完全失活，而纤溶酶保持相对耐热并在巴氏杀菌乳贮藏期间增加。这些发现强调了乳中蛋白酶平衡的动态性质，并表明加工和贮藏会随时间改变不同蛋白水解系统的相对贡献。尽管存在样本量较小、品种多样性受限等局限性，本研究通过强调蛋白酶平衡的概念，为理解牛乳蛋白酶系统及其对乳品加工、产品质量和货架期管理的潜在影响提供了新见解。