环腺苷酸-ArcRsa信号轴通过转录抑制ica操纵子调节乳源金黄色葡萄球菌生物膜形成

《Journal of Dairy Science》：The cyclic adenosine monophosphate-ArcRsa signaling axis modulates biofilm formation in dairy-derived Staphylococcus aureus via transcriptional repression of ica operon

　　

金黄色葡萄球菌（*Staphylococcus aureus*）因其能够在多种环境中定殖并形成生物膜，对乳制品和保藏食品的污染有显著贡献。ArcR（Crp/Fnr家族调控蛋白）在金黄色葡萄球菌中参与多种生物学过程。然而，由cAMP-ArcRsa复合物调控生物膜的分子机制尚不清楚。在本工作中，研究人员调查了ArcRsa在介导乳源金黄色葡萄球菌RMSA49生物膜形成中的生物学功能。结果表明，*arcRsa*的敲除导致生物膜形成显著增加。对ArcRsa调控机制的深入剖析揭示，其通过直接结合基因*icaA*的启动子，负调控多糖胞间黏附素（polysaccharide intercellular adhesin, PIA）的产生。进一步分析表明，cAMP-ArcRsa复合物通过增强对基因*icaA*的调控，支持金黄色葡萄球菌RMSA49的生物膜维持。ArcRsa通过结合位点*arcRsa*（5^′-ATCACGCGACAA-3^′）和位点*arcRsa2*（5^′-ATTAAGTTGCAA-3^′）上的特定序列，控制自身基因和*icaA*的转录。研究人员的结果证明了cAMP与ArcRsa之间通过直接调控基因*icaA*启动子的功能交互，支持cAMP–ArcRsa信号模块在调控金黄色葡萄球菌生物膜形成中的关键调控作用。

论文解读文章：

**研究背景与问题**
金黄色葡萄球菌（*Staphylococcus aureus*）是一种常见食源性病原菌，其通过定殖于乳腺、环境污染或操作者携带等方式污染原乳，并形成生物膜，导致乳制品安全风险。生物膜由自身分泌的胞外聚合物（extracellular polymeric substance, EPS）包裹，主要成分包括多糖胞间黏附素（polysaccharide intercellular adhesin, PIA）、细胞壁锚定蛋白和胞外DNA。PIA由*icaADBC*操纵子编码的酶合成，是生物膜结构完整性的关键因子。Crp/Fnr家族转录调控蛋白在细菌中广泛存在，但该家族成员ArcR在金黄色葡萄球菌生物膜调控中的分子机制尚不明确。环腺苷酸（cyclic AMP, cAMP）作为第二信使，常与Crp形成复合物调控基因表达，但cAMP-ArcRsa复合物在生物膜形成中的作用研究有限。为此，研究人员以乳源金黄色葡萄球菌RMSA49为模型，探究ArcRsa及其与cAMP的交互对生物膜形成的调控机制。论文发表在《Journal of Dairy Science》。

**主要关键技术方法**
研究采用同源重组技术（温度敏感质粒pBTs）构建*arcRsa*、*cyaA*及双缺失突变株（Δ*arcRsa*、Δ*cyaA*、Δ*arcRsa*/Δ*cyaA*），并构建互补菌株Δ*arcRsa*/C*arcRsa*和Δ*cyaA*/C*cyaA*。样本来源为乳源金黄色葡萄球菌RMSA49菌株，原始分离自生乳样品。生物膜定量采用96孔板结晶紫染色（crystal violet staining, CVS）法，结构分析借助共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscopy, CLSM）。基因表达分析通过RNA测序（RNA-seq）和逆转录定量PCR（RT-qPCR）进行；蛋白与DNA互作采用电泳迁移率变动分析（electrophoretic mobility shift assay, EMSA）和GusA转录融合报告系统。cAMP浓度测定采用高效液相色谱（high-performance liquid chromatography, HPLC）。ArcRsa蛋白通过大肠杆菌BL21 (DE3)表达并经Ni-NTA亲和层析纯化。

**研究结果**

**arcRsa缺失增强金黄色葡萄球菌RMSA49生物膜形成**
通过同源重组敲除*arcRsa*后，CVS和CLSM分析表明，Δ*arcRsa*突变株在24 h和36 h的生物膜形成显著高于野生型RMSA49，互补菌株恢复至野生型水平。生长曲线显示，Δ*arcRsa*与野生型在12 h后生长一致，排除生长差异对生物膜的影响，证实ArcRsa是生物膜形成的抑制因子。

**ArcRsa直接控制PIA的产生**
RNA-seq和RT-qPCR分析显示，Δ*arcRsa*中*icaADBC*操纵子（尤其是*icaA*）转录水平显著上调，而其他生物膜相关基因（如*fnbA*、*clfA*等）无显著变化。刚果红染色表明野生型菌株具有PIA合成活性，Δ*arcRsa*中PIA合成增强。EMSA证实ArcRsa直接结合*icaA*启动子（P_*icaA*），而GusA报告系统在体内验证了ArcRsa对*icaA*启动子的转录抑制作用，表明ArcRsa通过直接转录抑制*icaA*来负调控PIA合成，从而抑制生物膜形成。

**cAMP-ArcRsa复合物负调控RMSA49生物膜形成**
HPLC分析显示，Δ*cyaA*突变株（腺苷酸环化酶缺失）胞内cAMP不可检测，互补菌株恢复。CVS和CLSM表明，Δ*cyaA*生物膜形成增强，而Δ*arcRsa*/Δ*cyaA*双缺失株生物膜形成与Δ*arcRsa*相似，且外源添加cAMP（1 mM）仅恢复Δ*cyaA*的生物膜表型，对Δ*arcRsa*和双缺失株无效，证明cAMP和ArcRsa作为统一功能单元调控生物膜形成。

**cAMP增强ArcRsa与*icaA*启动子的结合**
RT-qPCR显示，外源添加cAMP后，Δ*arcRsa*中*icaABC*转录水平恢复至野生型，而Δ*cyaA**中*arcRsa*转录水平无显著变化。EMSA表明，加入cAMP可增强ArcRsa与P_*icaA*的结合亲和力，证实cAMP作为效应分子强化ArcRsa对靶基因的调控。

**ArcRsa结合位点的鉴定**
MEME基序分析在*arcRsa*启动子区域鉴定出12 bp保守序列（位点*arcRsa*：5^′-ATCACGCGACAA-3^′），在*icaA*启动子区域鉴定出匹配的12 bp基序（位点*arcRsa2*：5^′-ATTAAGTTGCAA-3^′）。EMSA使用突变探针Pd(*arcRsa*)验证了ArcRsa与位点*arcRsa*的特异性结合，同样鉴定出ArcRsa与P_*icaA*中位点*arcRsa2*的结合。

**讨论与结论**
讨论部分指出，Crp/Fnr家族调控蛋白在不同细菌中表现出较低的同源性，而本研究中ArcRsa通过形成cAMP-ArcRsa复合物，直接转录抑制*icaA*，从而抑制PIA合成和生物膜形成。研究首次建立了乳源金黄色葡萄球菌中Crp/Fnr家族转录调控因子与生物膜形成的调控关联。此外，cAMP结合ArcRsa增强了其与*icaA*启动子的特异性结合，驱动*ica*操纵子下调，最终减少生物膜。ArcRsa的结合位点（位点*arcRsa*和位点*arcRsa2）的鉴定为靶向调控提供了分子基础。研究结论翻译：总之，本研究表明，乳源金黄色葡萄球菌RMSA49中新型Crp/Fnr家族调控因子ArcRsa作为cAMP-ArcRsa调控轴的核心组分，调控生物膜形成，提供了明确的机制见解，将该信号通路确定为开发新型抗生物膜治疗策略的潜在靶点。