蛋白酶解驱动的保加利亚德氏乳杆菌亚种（Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus）、副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）与马克思克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）共发酵乳质地与生物活性增强机制

《Journal of Dairy Science》：Proteolysis-driven enhancement of texture and bioactivity in milk co-fermented with Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Lacticaseibacillus paracasei, and Kluyveromyces marxianus

　　

本研究旨在阐明马克思克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）DPUL-F15与保加利亚德氏乳杆菌亚种（Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus）DPUL-F36及副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）DPUL-F115联合应用，如何通过加速蛋白酶解增强发酵乳质地与功能特性的机制。研究结果显示，仅接种保加利亚德氏乳杆菌亚种DPUL-F36与副干酪乳杆菌DPUL-F115的发酵乳作为无酵母对照组，而三菌株共发酵乳在发酵及后续贮藏期间表现出显著更强的酸化与蛋白水解活性。同样，三菌株产品在贮藏全期呈现出更优的凝胶特性，以及增强的体外降血压（antihypertensive）与抗氧化（antioxidant）能力。肽组学分析表明，这些观察结果可由酪蛋白源肽数量增加及相应生物活性肽（bioactive peptide, BP）丰度上升解释，这些肽主要具有降血压与抗氧化活性。值得注意的是，利用BIOPEP-UWM等数据库预测显示，大多数此类生物活性肽具备良好的体内活性与鲜味潜力。分子对接分析进一步鉴定了这些降血压肽（酪氨酸Tyr）、抗氧化肽（天冬氨酸Asp、天冬酰胺Asn、苯丙氨酸Phe与丝氨酸Ser）及鲜味肽（谷氨酸Glu、丝氨酸Ser与天冬酰胺Asn）的关键结合残基，其中氢键为主要相互作用。综上所述，马克思克鲁维酵母DPUL-F15共发酵增强了蛋白酶解并富集了发酵乳中酪蛋白源肽，从而优化了凝胶质地，改善了生物活性与鲜味。这揭示了乳酸菌与酵母的协同机制，并支持了高价值功能性发酵乳的靶向开发。

该研究发表于《Journal of Dairy Science》。乳制品发酵包含复杂的生化反应，可产生多种风味物质与健康促进型生物活性化合物，赋予发酵乳制品独特风味特征与高营养价值，已获得全球广泛消费者认可。其中，发酵剂（starter cultures）的蛋白水解活性是决定产品质量的关键因子，催化乳蛋白水解为肽与氨基酸（AAs），显著塑造发酵乳基质的结构与功能属性。因此，筛选开发具有优异蛋白水解性能的发酵剂对发酵乳制造至关重要。迄今为止，研究最广泛的此类发酵剂为乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB），其因独特的蛋白水解系统（包括胞壁蛋白酶、转运系统与胞内肽酶）而被青睐，常用于发酵乳与奶酪生产。相比之下，酵母虽也表现出显著的蛋白水解能力，但在发酵剂开发中仍未充分利用，尽管已知其在开菲尔粒中与乳酸菌共发酵，且克鲁维酵母（Kluyveromyces）与乳杆菌（Lactobacillus）的相互作用可增强蛋白水解活性。因此，整合乳酸菌与酵母以实现新颖优越蛋白水解特性的混合发酵剂仍极为稀缺，值得深入研究。现有研究缺口具体体现为保加利亚德氏乳杆菌（L. bulgaricus）DPUL-F36、副干酪乳杆菌（L. paracasei）DPUL-F115与高蛋白水解性马克思克鲁维酵母（K. marxianus）DPUL-F15共发酵生产的发酵乳，虽先前工作已确认该共发酵剂的优异发酵性能，但其蛋白水解、肽代谢及对发酵乳质量的相关影响仍不清楚。为此，研究人员比较含与不含该酵母菌株的发酵系统的蛋白水解谱，以进一步揭示乳酸菌-酵母协同互作并指导优质发酵乳制品配方设计。

研究人员开展的研究为：以新疆发酵乳分离保存于大连益生菌功能研究重点实验室的L. bulgaricus DPUL-F36、L. paracasei DPUL-F115与K. marxianus DPUL-F15为菌株，制备仅接种前两株菌的LbLp组与额外接种K. marxianus DPUL-F15的LbLpK组发酵乳，于发酵中期（MF）、结束（EF）及贮藏第1、7、14天（S1d、S7d、S14d）取样，测定理化与蛋白水解特征、凝胶结构与功能、酪蛋白蛋白水解与肽表征、发酵乳中生物活性肽（BP）预测表征及分子对接。研究得出：K. marxianus DPUL-F15共发酵显著提升酸化与酪蛋白降解，LbLpK组酸蛋白酶活性更高、蛋白浓度显著降低、水解度更高，β-酪蛋白等电泳条带强度降低更明显；LbLpK初期持水性（WHC）较低但后期超越LbLp且不显著，质地参数从S7d起逐步改善并超越LbLp，弹性模量在S1d–S14d优于LbLp，LbLpK具更长冷贮与质地稳定潜力；LbLpK贮藏期血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI）率持续高于LbLp且S1d差异显著，S7d达52.55%±2.51%接近阳性对照卡托普利（CAP）5 mmol/L的59.41%±1.44%，DPPH自由基清除率在S14d显著高于LbLp，ABTS自由基清除率趋势与ACEI类似且S14d差异显著；主成分分析（PCA）显示发酵贮藏期、发酵剂差异尤其K. marxianus辅助发酵显著改变肽组成，共鉴定336条肽，218条源自酪蛋白占64.88%，β-酪蛋白优先水解产出116条肽占34.52%，LbLpK中酪蛋白源肽计数随进度递增且β-酪蛋白占比最大，α-S1-酪蛋白比例在贮藏期逐渐超κ-酪蛋白成次大来源，LbLpK在S14d的7–8氨基酸残基肽数量为LbLp两倍且1000–1400 Da肽比例随时间依赖增加；LbLpK在特定时间点富集10条与MBPDB和BIOPEP-UWM数据库精确匹配的BP，主要源自β-酪蛋白等多酪蛋白组分，具无毒性、多数分子量低于1600 Da、9条等电点（pI）4–6、6条负GRAVY分值、4条PeptideRanker评分>0.5，模拟消化除SDIPNPIGSE（仅胃消化）与VIESPPEIN（序贯胃肠消化）外均降解为更小片段且部分片段保留或改变活性，6条BP被预测具鲜味活性归因于Glu、Asp、Asn残基；分子对接显示降血压BP与ACE结合能分别为?10.45、?8.46、?9.73、?9.65、?11.53 kcal/mol，抗氧化BP FSDIPNPIGSE与FSDIPNPIGSEN对DPPH和ABTS结合能分别为?2.43、?2.17、?1.63、?1.17 kcal/mol，鲜味BP与T1R1-T1R3受体结合能均低于?6.00 kcal/mol，分别以Tyr、Asp/Asn/Phe/Ser、Glu/Ser/Asn为关键残基主要通过氢键作用。重要意义在于证实乳酸菌-酵母共发酵是通过蛋白水解衍生肽提升发酵乳质量的强力工具，为开发增值发酵产品提供关键指导。

主要关键技术方法包括：菌株活化与发酵乳制备（样本菌株分离自新疆发酵乳，保藏于大连益生菌功能研究重点实验室，设LbLp与LbLpK两组发酵体系并于MF、EF、S1d、S7d、S14d取样）；理化与蛋白水解特征测定（pH计测pH、改良离心法测持水性（WHC）、Folin-Ciocalteu法测酸与中性蛋白酶活性、BCA法测蛋白浓度、邻苯二甲醛法测水解度、SDS-PAGE分析蛋白表达）；凝胶结构与功能评价（质构分析仪测硬度/一致性/凝聚性/黏度指数、旋转流变仪测弹性模量与黏性模量、ACEI试剂盒测降血压（AH）活性、DPPH与ABTS试剂盒测抗氧化（AO）活性）；肽组学分析（超滤分离<10 kDa肽段、Orbitrap Exploris 240质谱联用Vanquish Neo高效液相色谱C18反相柱分析）；生物信息学预测（MBPDB与BIOPEP-UWM数据库预测BP活性、PeptideRanker评活性概率、ToxinPred评毒性、Biopython算pI与GRAVY、BIOPEP-UWM酶作用工具模拟胃肠消化、Umami-YYDS与Tastepeptides_DM预测鲜味）；分子对接（Schr?dinger与AutoDock Tools处理BP与ACE（PDB ID: 1O8A）、DPPH、ABTS、Swiss-Model建模T1R1-T1R3结构并批量对接分析）。

研究结果保留小标题并说明如下：

理化与蛋白水解特征（Physicochemical and proteolysis characteristics of fermented milk）：下设pH、蛋白酶与蛋白水解（Proteases and proteolysis）、结构与功能（Structure and function）子标题。pH结果显示LbLp与LbLpK的pH在MF–EF整体下降，EF到S1d显著升高后S1d–S14d逐渐下降，波动在4–6且LbLpK始终更低（MF–S14d，P < 0.01或P < 0.0001），凝乳提前约0.5 h；蛋白酶与蛋白水解显示LbLp与LbLpK的中性与酸蛋白酶活性从EF到S14d递增，酸蛋白酶75–150 U/mL高于中性蛋白酶60–100 U/mL，LbLpK酸蛋白酶活性在S7d–S14d显著高于LbLp（P < 0.05或P < 0.01），LbLpK蛋白浓度显著降低（MF–S14d，P < 0.01或P < 0.0001）且蛋白水解度更高（S1d，P < 0.001；S14d，P < 0.01），SDS-PAGE中LbLpK的α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-乳白蛋白与β-乳球蛋白条带强度降低更明显尤以β-酪蛋白为甚；结构与功能显示LbLpK的WHC初期低于LbLp后S14d反超但不显著，质地参数从S7d起改善并超越LbLp（S7d与S14d四项指标差异各异），EF到S1d弹黏模量波动表明LbLpK耐低温性优于LbLp且S1d–S14d弹性模量更优，LbLpK贮藏期ACEI率持续更高（S1d显著差异P < 0.01，S7d达52.55%±2.51%近CAP阳性对照59.41%±1.44%），DPPH清除率从约27%微升至28%而LbLp持续下降（S14d显著高于LbLp P < 0.001），ABTS清除率趋势同ACEI且S14d显著差异（P < 0.001），表明乳酸菌-酵母共发酵改善功能特性归因于生物活性肽形成。

酪蛋白蛋白水解与发酵乳肽表征（Casein proteolysis and peptide characterization in fermented milk）：下设酪蛋白为首选底物（Casein as the preferred substrate）、酪蛋白源肽的系统谱学分析（Systematic profiling of casein-derived peptides）、酪蛋白切割位点特异性（Cleavage site specificity of casein）子标题。酪蛋白为首选底物显示主成分分析（PCA）将样品肽分MF、EF–S1d、S14d三区且S1d的LbLp与LbLpK明显分离，共鉴定336条肽中218条酪蛋白源占64.88%，β-酪蛋白源116条占34.52%为最优先水解，α-S1-、κ-、α-S2-酪蛋白源分别52、35、15条占15.48%、10.42%、4.46%，LbLpK中四种酪蛋白前体肽的蛋白状态值（PSV）随时间不同程度降低尤以EF–S14d的β-与κ-酪蛋白为甚，与SDS-PAGE条带变化一致；酪蛋白源肽的系统谱学分析显示LbLpK中酪蛋白源肽计数渐进增加而LbLp无此趋势，β-酪蛋白占比最大α-S2-酪蛋白最低，LbLpK中α-S1-酪蛋白比例初期低后在贮藏期逐渐超κ-酪蛋白成次大来源，各时间点肽长度8–18残基（MF）至7–21残基（S14d）且9–12残基为主，LbLpK在S14d的7–8残基肽数为LbLp两倍且1000–1400 Da肽比例随时间依赖增加而LbLp无；酪蛋白切割位点特异性显示肽主要源自α-S1-酪蛋白与κ-酪蛋白的N/C端、α-S2-酪蛋白C端与近乎全序列β-酪蛋白，LbLp偏好切α-S1-酪蛋白C端190–214（S14d）、α-S2-酪蛋白C端190–222（S14d）与κ-酪蛋白C端140–160（EF–S14d），LbLpK对β-酪蛋白C端180–200（S1d–S14d）切割更强，热图显示LbLpK肽在α-S1-酪蛋白f(61–71)、f(137–147)、f(188–195)与κ-酪蛋白f(32–41)氨基酸频率更高，印证K. marxianus促进酪蛋白水解产肽。

发酵乳中生物活性肽（BP）的预测与表征（Prediction and characterization of BPs in fermented milk）：下设预测形成与理化性质（Prediction, formation and physicochemical properties）、模拟消化（Simulated digestion）、鲜味预测（Umami prediction）子标题。预测形成与理化性质显示相比LbLp，LbLpK在特定时间点富集10条与MBPDB和BIOPEP-UWM精确匹配的BP主要源自β-酪蛋白等多酪蛋白组分，经证实具ACEI与AO等活动，ToxinPred预测无毒性，7条分子量<1600 Da，9条pI 4–6高于胃液pH而带正电增溶，6条负GRAVY分值（SDIPNPIGSE最低?0.67）具优生物利用度，4条PeptideRanker>0.5示强生物活性，整合理想理化与生物活性可作功能食品成分；模拟消化显示除SDIPNPIGSE（仅胃消化）与VIESPPEIN（序贯胃肠消化）未被降解外其余BP均解为更小片段，二者因富Pro残基抗消化酶，水解片段中YQEPVL、PQ、VY保留母肽活性而GPF、VL、PF、PGPIPN、SL、HL、PL活性改变，PeptideRanker评新片段中GPF、PF、PGPIPN、PL>0.5（PF与GPF达0.99），示母肽YQEPVLGPVRGPFPIIV、QEPVLGPVRGPFPIIV、LVYPFPGPIPNSLPQ具高生物活性潜力；鲜味预测显示10条BP中6条被Umami-YYDS、Tastepeptides_DM与BIOPEP-UWM同时预测具鲜味：YQEPVLGPVRGPFPIIV、FSDIPNPIGSE、FSDIPNPIGSEN、SDIPNPIGSE、DVENLHLPLPL、VIESPPEIN，鲜味归因于序列中Glu、Asp、Asn残基。

发酵乳中BP的分子对接（Molecular Docking of BPs in fermented milk）：下设ACEI BP与ACE对接（Docking between ACEI BPs and ACE）、AO BP与DPPH或ABTS对接（Docking between AO BPs and DPPH or ABTS）、鲜味BP与T1R1/T1R3对接（Docking between umami BPs and T1R1/T1R3）子标题。ACEI BP与ACE对接显示YQEPVLGPVRGPFPIIV、SQSKVLPVPQ、QEPVLGPVRGPFPIIV、NIPPLTQTPV、LVYPFPGPIPNSLPQ与ACE结合能分别为?10.45、?8.46、?9.73、?9.65、?11.53 kcal/mol，具有利空间互补性，氢键、盐桥、BP内Tyr残基与ACE的S2口袋His-513为维持高亲和关键；AO BP与DPPH或ABTS对接显示FSDIPNPIGSE与DPPH、ABTS及FSDIPNPIGSEN与DPPH、ABTS结合能分别为?2.43、?2.17、?1.63、?1.17 kcal/mol，FSDIPNPIGSE对DPPH亲和力高于多数报道新型AO BP，疏水相互作用、氢键与BP内Asp、Asn、Phe、Ser等关键残基决定高亲和；鲜味BP与T1R1/T1R3对接显示6条预测鲜味BP与T1R1-T1R3结合能均低于?6.00 kcal/mol示强亲和，氢键（占总数76.67%）、BP的C端与亲水残基（Glu、Ser、Asn）及受体Ser-170与His-145为关键决定因子。

讨论部分总结：研究人员讨论指出发酵与贮藏期、发酵剂差异尤其K. marxianus辅助发酵显著改变肽组成，酪蛋白为首选底物且β-酪蛋白最优先水解，LbLpK中酪蛋白源肽计数随进度递增且切割模式不同于LbLp，LbLpK在特定时间点富集10条数据库匹配BP具无毒性与优良理化及潜在体内活性与鲜味，模拟消化显示部分BP具消化稳定性或部分水解片段保留高评分活性，分子对接证实降血压、抗氧化与鲜味BP分别以Tyr、Asp/Asn/Phe/Ser、Glu/Ser/Asn为关键残基主要通过氢键稳定结合对应受体。结论部分翻译为：将K. marxianus DPUL-F15纳入两菌株乳酸菌共发酵剂（L. bulgaricus DPUL-F36与L. paracasei DPUL-F115）显著促进了乳发酵与贮藏期间的蛋白酶解。这种增强的蛋白酶解增加了酪蛋白源生物活性肽（BP）的丰度，主要表现为血管紧张素转化酶抑制（ACEI）与抗氧化（AO）潜力，从而改善凝胶质地并增强体外ACEI与AO活性。许多此类BP表现出有益的体内活性与鲜味潜力，通过关键结合残基（如降血压的Tyr；抗氧化的Asp、Asn、Phe、Ser；鲜味的Glu、Ser、Asn）发挥作用，主要以氢键为相互作用。总体而言，这些发现证实乳酸菌-酵母共发酵是通过生成蛋白酶解衍生肽提升发酵乳质量的强力工具，为开发高附加值发酵产品提供了关键指导。

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