膦酸霉素和膦酸酯衍生物的手性高效液相色谱分离及分离对映体的电子圆二色谱表征

《ELECTROPHORESIS》：Chiral HPLC Separation of Phosphonothrixin and Phosphonate Derivatives and Electronic Circular Dichroism Characterization of the Isolated Enantiomers

　　

膦酸霉素（Phosphonothrixin, PPX），一种磷酸酯天然产物，以其强效的除草活性而闻名，由于对替代除草剂的需求，重新引起了人们的兴趣。其生物活性仅限于(S)-对映体。尽管唯一报道的对映选择性合成方法复杂、劳动密集且产率低，但直接的手性液相色谱分离同样具有挑战性，因为其极性高且缺乏芳香基团，限制了与常用手性固定相（chiral stationary phases, CSPs）的相互作用。此外，含膦酸化合物倾向于螯合金属离子并吸附在金属表面上，通过引起明显的峰拖尾进一步使色谱分离复杂化。在这里，研究人员描述了一种可靠且可重现的分析和制备方法，用于PPX的直接手性分离，使用两性离子磺己基奎尼丁和奎宁氨基甲酸酯CSPs，以及作为替代方法的两种合成膦酸酯衍生物，使用纤维素三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)固定相。PPX的最佳分离是通过两性离子磺己基奎尼丁CSP实现的（Rs = 2.4）。分离的对映体被分离，并通过质谱、旋光度和电子圆二色谱（electronic circular dichroism, ECD）确认了其化学和立体化学身份。该方法成功分离了光学纯的(S)-(?)-和(R)-(+)-PPX。

膦酸霉素（Phosphonothrixin, PPX）是一种天然膦酸酯类除草剂，其生物活性仅存在于(S)-对映体，而(R)-对映体无活性。由于现有对映选择性合成路线复杂、产率低且难以放大，因此从消旋体中直接进行手性分离成为获取(S)-和(R)-对映体的重要替代途径。然而，PPX因其高极性、缺乏芳香基团、膦酸基团易与金属螯合及吸附，导致在常规手性固定相（CSPs）上保留弱、峰拖尾严重，迄今尚无直接手性高效液相色谱（HPLC）分离的报道。为此，研究人员开展本研究，旨在建立可靠、可重现的分析及制备级手性分离方法，并利用圆二色光谱（ECD）和旋光测定确认分离对映体的绝对构型。该论文发表在《ELECTROPHORESIS》。

研究人员为开展研究主要采用了以下关键方法：使用两性离子磺己基奎尼丁（ZWIX(?)）和奎宁（ZWIX(+)）氨基甲酸酯手性固定相，以及纤维素三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)（Chiralpak IC-U）多糖固定相；通过优化流动相组成（甲醇/乙腈/水、缓冲液浓度）、温度、流速等参数实现最佳分离；利用制备级液相色谱从消旋样品中分离对映体；采用实验ECD光谱与量子力学计算（B3LYP/def2-TZVP水平）的ECD谱比较，结合旋光测量进行绝对构型归属。样品来源为合成的消旋PPX及其二苄基膦酸酯衍生物（DBP）和缩丙酮衍生物（ABP）。

**3.1 手性固定相筛选**
通过比较多种多糖类CSP（纤维素和直链淀粉衍生物）及两性离子CSP，发现仅有ZWIX(+)能直接分离PPX对映体，而Chiralpak IC-U（纤维素三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)）可分离DBP对映体。PPX因极性高、无芳香环，在常规CSP上无保留，而两性离子CSP通过质子化奎宁环与膦酸基团的弱阴离子交换作用实现分离。DBP在IC-U上的分离得益于苯环与选择子间的π-π相互作用。

**3.2 优化手性液相色谱分离条件**
（1）DBP和ABP在Chiralpak IC-U上的优化：有机改性剂以乙腈（ACN）优于甲醇（MeOH），可提高柱效和选择性；等度洗脱（30% ACN/水）在15°C、0.2 mL min^?1下实现基线分离（Rs = 1.33）。ABP在梯度洗脱下获得Rs = 1.48。
（2）PPX在ZWIX(+)上的优化：流动相为MeOH/ACN/H₂O（49:49:2, v/v/v）含100 mM甲酸和50 mM氨水，15°C、0.2 mL min^?1，通过调节水含量（2%最佳）和酸/碱比例（2:1）获得Rs = 1.18。

**3.3 PPX的制备液相色谱对映体分离**
在ZWIX(+)柱上，通过上样量研究（80 μg）获得良好分离，重复性高（RSD 0.024%）。收集的馏分F1（e.e. >99%）和F2（e.e. 94.5%），经质谱确认化学身份。

**3.4 ZWIX(?)柱的洗脱顺序反转评价**
采用ZWIX(?)（奎尼丁型）柱在相同条件下分离，洗脱顺序与ZWIX(+)相反，且分辨率更高（Rs = 2.4）。旋光测量表明：第一洗脱峰（t_R = 8.3 min）的比旋光度为?4.4（c=1.00, H₂O），与文献报道的天然(S)-(?)-PPX一致（[α]_D = ?4.1），故确定为(S)-(?)-PPX；第二洗脱峰（t_R = 11.2 min）比旋光度为+3.3，为(R)-(+)-PPX，两者e.e.均>99%。

**3.5 PPX对映体的ECD光谱**
实验ECD谱与基于量子力学计算的谱图（考虑55%单阴离子和45%二阴离子物种的Boltzmann加权平均）在Cotton效应的符号、顺序和整体轮廓上呈现良好定性一致。第一洗脱峰（E1）在190–210 nm区域显示强正Cotton效应，与(S)-对映体计算谱吻合；第二洗脱峰（E2）显示强负Cotton效应，与(R)-对映体计算谱吻合，进一步支持了绝对构型归属。

**结论**
研究人员开发了一种适用于PPX分析及制备级手性分离的液相色谱方法。由于PPX高极性、无芳香基团及膦酸基团易吸附金属，直接分离极具挑战性。通过两性离子磺己基奎宁和奎尼丁CSP，成功实现了PPX对映体的基线分离，其中ZWIX(?)柱（Rs = 2.4）在约16分钟内提供了最佳分离效果。未来工作可尝试使用更强反离子（如磷酸盐缓冲液）结合高温以减少峰拖尾。分离得到的(S)-(?)-和(R)-(+)-PPX经旋光和ECD表征确认为光学纯。该研究为获取毫克级PPX对映体提供了可靠策略，并有望放大至更大批量。