《Journal of Food Composition and Analysis》：Closed recycling eco-friendly strategy for pre-capillary derivatization and staking: Enhancing sensitivity and sustainability for measuring folic acid in food supplement
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研究人员开发了一种零废弃循环分析化学（CAC）方法，用于测定叶酸（FA），该方法采用基于绿色预毛细管衍生化的场放大样品堆积毛细管区带电泳结合荧光检测（FASS-CZE-FLD）。在温和条件下（磷酸盐溶液（0.04 M，pH 3.4，65°C，连续搅拌2分钟），
研究人员开发了一种零废弃循环分析化学（CAC）方法，用于测定叶酸（FA），该方法采用基于绿色预毛细管衍生化的场放大样品堆积毛细管区带电泳结合荧光检测（FASS-CZE-FLD）。在温和条件下（磷酸盐溶液（0.04 M，pH 3.4，65°C，连续搅拌2分钟），使用可回收铈氧化剂（CTHPO）将FA衍生化为高荧光产物。该策略提供了关于废CTHPO再活化及所用流动相再循环的新见解，采用封闭循环环保方法，实现了CAC目标的9/12和基于10R的资源节约与循环经济循环指数（CIRCLE）的90%。对于FASS，衍生化的FA在预注入水塞6秒后，以16 kV电动注射进入毛细管。CZE使用0.40 M磷酸氢二钾（pH 11）作为背景电解质溶液，在12 kV下进行。荧光衍生物在激发波长367 nm和发射波长463 nm处进行定量。良好的线性（5-150 ng/mL）、决定系数0.9996、分析性能、绿色性和实用性突出了该方法在实现灵敏度的同时增强环境可持续性和实用性的能力，证实了其作为CAC方法在食品补充剂片剂中FA质量控制中的成功实施。
**研究背景与问题**
叶酸（FA）是B族维生素（B9），参与人体氨基酸转化和嘌呤嘧啶合成等关键代谢过程，在食品和制药领域广泛用作补充剂。准确测定FA对产品质量控制和疗效评估至关重要。现有方法包括高效液相色谱（HPLC）、超高效液相色谱（UHPLC）、液相色谱-质谱联用（LC-MS）、光谱法、电化学法和微生物法等，但多数方法存在灵敏度不足、使用有毒试剂、产生大量废物或操作复杂等问题。毛细管电泳（CE）具有分离效率高、试剂消耗少和操作简便等优点，但灵敏度通常较低，因毛细管内径窄导致进样量受限。场放大样品堆积（FASS）是一种有效的在线预浓缩技术，可显著提升CE灵敏度。此外，传统衍生化试剂多为一次性使用，不符合绿色分析化学（GAC）和循环分析化学（CAC）理念。因此，研究人员旨在开发一种结合绿色预毛细管衍生化、FASS和荧光检测（FLD）的可持续方法，以实现FA的高灵敏度和环保检测，满足食品补充剂质量控制需求。该研究发表在《Journal of Food Composition and Analysis》。
**开展的研究与结论**
研究人员开发了一种零废弃循环分析化学（CAC）方法，即基于绿色预毛细管衍生化的FASS-CZE-FLD方法，用于测定FA。该方法使用可回收的铈氧化剂（CTHPO）在温和条件下将FA氧化为高荧光衍生物（AHPT-COOH和AHPT-CHO），并设计了封闭循环环保策略（CRES）用于废CTHPO的再活化及所用流动相的再循环。优化了衍生化条件（pH、磷酸盐浓度、温度、搅拌时间）、CZE分离条件（背景电解质pH、浓度、分离电压）和FASS参数（水塞时间、BGE浓度、注射时间、注射电压）。方法验证显示，在5-150 ng/mL范围内线性良好（决定系数0.9996），检测限（LOD）为1.2 ng/mL，定量限（LOQ）为4.25 ng/mL，日内和日间精密度（相对标准偏差RSD）低于4%，回收率在96.6%-98.2%之间。方法成功应用于商业食品补充剂片剂中FA的测定，回收率97.8%，RSD 3.2%。通过CIRCLE、MoGAPI、AGSA、CACI和AMRI等工具评估，该方法在绿色性和实用性方面得分分别达到90、86、77.78、78和76，优于现有方法。该方法实现了CAC目标的9/12和CIRCLE目标的90%，显著降低了化学废物和试剂消耗。
**关键的技术方法**
1. **预毛细管衍生化**：使用可回收固体氧化剂CTHPO（铈(IV)三羟基氢过氧化物）在磷酸盐溶液（0.04 M，pH 3.4，65°C，连续搅拌2分钟）中将FA氧化为高荧光产物AHPT-COOH和AHPT-CHO。
2. **场放大样品堆积（FASS）**：先以水动力方式预注入水塞6秒，再以16 kV电动注射衍生化样品20秒，通过低电导水塞与高电导BGE之间的电场差异实现样品在线浓缩，灵敏度提升16倍。
3. **毛细管区带电泳-荧光检测（CZE-FLD）**：使用0.40 M磷酸氢二钾（pH 11）作为背景电解质，在12 kV分离电压下进行，荧光检测激发波长367 nm，发射波长463 nm。
4. **封闭循环环保策略（CRES）**：通过柱切换系统，将废CTHPO固体材料填充于不锈钢柱中，依次用超纯水、氢氧化铵和过氧化氢冲洗，实现CTHPO再活化，同时将所用流动相再循环至原储液瓶，形成闭环系统。样本来源：埃及Mepaco Medifood Enshas生产的叶酸食品补充剂片剂（500 μg/片）。
**研究结果**
- **3.1 预毛细管衍生化参数优化**：通过考察pH（2.8-5.0）和磷酸二氢钾浓度（0.01-0.10 M），确定最优条件为0.04 M磷酸二氢钾（pH 3.4），此时荧光产物AHPT-COOH信号最强；通过考察温度（25-70°C）和搅拌时间（0.5-5分钟），确定最优条件为65°C连续搅拌2分钟，此时AHPT-COOH占主导，AHPT-CHO/AHPT-COOH响应比显著降低。
- **3.2 CRES实现废CTHPO再活化与流动相循环**：通过设计的CRES系统，将废CTHPO柱依次用超纯水、氢氧化铵、超纯水、过氧化氢冲洗，再活化后的CTHPO与新鲜试剂相比，FA荧光信号回收率分别为95.16%-96.73%和96.46%-97.03%，无显著差异；流动相可循环使用，达到近零废物效果。
- **3.3 CZE操作条件优化**：通过考察BGE pH（6-11）和浓度（0.10-1.00 M），确定0.40 M磷酸氢二钾（pH 11）为最优，此时AHPT-COOH与AHPT-CHO分离良好，FASS预浓缩效果最佳；通过考察分离电压（8-14 kV），确定12 kV为最佳平衡点，兼顾分离效率与焦耳热。
- **3.4 FASS操作条件优化**：通过优化水塞时间（1-10秒），确定6秒为最优，避免过度水塞导致峰形变差；通过优化BGE浓度（0.05-0.50 M），确定0.40 M为最优，此时样品基质（0.04 M磷酸二氢钾）与BGE浓度差最大，增强因子最高；通过优化电动注射时间（4-24秒），确定20秒为最优，注射时间超过20秒时堆积效率下降；通过优化电动注射电压（4-20 kV），确定16 kV为最优，20 kV时基线噪声增加；最终，与常规水动力注射CZE相比，FASS使灵敏度提升16倍，且系统可视为以电导率堆积为主、pH结效应为辅的混合堆积模式。
- **3.5 方法验证**：线性范围5-150 ng/mL，决定系数0.9996，LOD 1.2 ng/mL，LOQ 4.25 ng/mL；日内和日间回收率分别96.6%-98.2%和96.2%-97.7%，RSD分别2.6%-3.8%和3.1%-4.2%，相对误差（RE）分别为-3.4%至-1.8%和-3.9%至-2.2%；稳健性测试显示，在±2%范围内改变衍生化、FASS和CZE参数，对荧光信号无显著影响。
- **3.6 应用**：对商业食品补充剂片剂中FA测定，回收率97.8%（RSD 3.2%），标准加入法回收率97.8%和98.3%（RSD<3.2%），表明方法准确可靠，无基质干扰。
- **3.7 经济、实用和环保优势**：与传统CE-UV方法（LOD 0.07-5.3 μg/mL）和CE-CL方法（LOD 8.82 ng/mL）相比，本方法LOD 1.2 ng/mL显著更优；分离电压12 kV低于其他方法（16-28 kV），降低能耗；CRES实现CTHPO再活化和流动相循环，减少废物和试剂消耗。
- **3.8 与CAC目标的一致性**：方法满足CAC 12项目标中的9项（目标1-3、5-9、12），包括废物收集再利用、设计消除废物污染、优化资源效率、最小化危害、应用R阶梯（减量、回收、再利用）、评估可持续性（CIRCLE达成90%）、反思商业模式、促进创新和转变消费。
- **3.9 比较评估**：与12种已报道FA测定方法（包括HPLC、电化学、光谱法、CE等）相比，本方法在CIRCLE、MoGAPI、AGSA、AMRI和CACI五项可持续性评估工具中得分均最高或接近最高（90、86、77.78、76、78），表明其在灵敏度、绿色性和实用性之间达到最佳平衡。
**讨论总结与结论翻译**
讨论部分强调，传统衍生化试剂产生不可回收废物，而本方法通过CRES实现了CTHPO再活化与流动相循环，达到近零废物；同时，FASS与荧光检测联用克服了CE灵敏度不足的问题。与现有CE方法相比，本方法在灵敏度、试剂循环性和溶剂使用方面具有显著优势。CRES系统通过简单柱切换设计，实现安全闭环操作，避免了纯化步骤。此外，该方法在实验室中利用商购组件组装低成本CE系统，提高了实用性。
结论部分翻译：
为了增强荧光检测系统对叶酸进行毛细管区带电泳测定的能力，研究人员采用了一种多层面策略，即基于绿色预毛细管衍生化的FASS-CZE-FLD方法，包括：（i）将CE仪器与FLD联用，（ii）利用无害的CTHPO氧化剂进行预毛细管衍生化以提高FLD响应灵敏度，以及（iii）应用在线FASS技术对衍生化FA进行预浓缩，无需对仪器进行额外修改。在所开发的循环分析化学策略框架内，采用可持续化学修饰提供了一个令人信服的机会，以减轻传统衍生化技术持续带来的不良环境影响。通过可回收的CTHPO氧化剂材料，以简单方式成功实现了FA氧化用于预毛细管衍生化，从而直接获得可测量的主要荧光信号AHPT-COOH。CTHPO氧化剂在整个合成过程中仅依赖无机试剂，并利用过氧化氢进行再活化。因此，以往FA分析中使用的废CTHPO材料可通过CRES方法用过氧化氢集体再活化。此外，用于再活化废CTHPO材料的封闭流动构型，通过再循环过氧化氢或氢氧化铵，提供了减少试剂和溶剂分装步骤的优势。因此，同步执行CRES方法（包括废CTHPO材料的再活化和流动相的再循环）以及应用CZE以减少试剂消耗，可以大大提高分析化学的可持续性和经济性。此外，设计良好且简单的CRES技术可以显著降低最终处置化学品的成本和数量，从而在追求零废物方面发挥关键作用。因此，将基于绿色预毛细管衍生化的FASS-CZE-FLD方法与CAC相关联，实现了12项目标中的9项。此外，利用CIRCLE对建立的方法进行循环性能评估，表明其与90%的目标一致。再活化的CTHPO材料与FA的反应与新鲜制备的试剂相当。此外，所提出的方法表现出优异的分析性能、绿色性和实用性，所有当代指标得分均超过75/100。该方法还表现出良好的线性（5-150 ng/mL），决定系数为0.9996，精密度（RSD）低于4%，回收率在96.6%至98.2%之间。将所提出的基于CRES的FASS-CZE-FLD方法成功应用于商业食品补充剂片剂，突显了其用于常规质量控制的可靠性，同时支持环境可持续的分析方法。
